發(fā)布時間：2020-05-21 05:26

【摘要】：目的:1.構建和鑒定脂質運載蛋白2(Lipocalin 2,Lcn2)基因重組減毒沙門氏菌。2.探討攜帶Lipocalin 2的減毒沙門氏菌對分枝桿菌生長的影響。方法:1.以巨噬細胞RAW264.7提取RNA逆轉錄為c DNA為模版,采用PCR法擴增Lcn2基因,定向克隆到質粒p Bud CE4.1-orim的多克隆位點中,構建重組質粒p Bud CE4.1-orim-Lcn2;將重組質粒p Bud CE4.1-orim-Lcn2轉染RAW264.7細胞,用RT-q PCR法檢測Lcn2的m RNA表達。2.將重組質粒轉入減毒沙門氏菌SL7207得到重組菌株SL7207-p Bud CE4.1-orim-Lcn2;重組菌感染RAW264.7細胞,用Western blot檢測Lcn2的蛋白表達,RT-q PCR法檢測Lcn2的m RNA表達;7H10平板上通過菌落計數觀察重組菌對感染RAW264.7細胞的BCG生存的影響。3.用重組菌以灌胃的方式感染BALB/c小鼠后,檢測脾組織中Lcn2表達,血清中IFN-γ和IL12的水平。4.建立BCG小鼠感染模型,以重組菌治療后通過肺組織荷菌量和肺組織病理變化觀察其對分枝桿菌生長的影響。結果:1.成功構建Lipocalin 2基因重組質粒,經雙酶切及基因測序鑒定正確。重組質粒轉染RAW264.7后用RT-q PCR法檢測Lcn2的m RNA表達升高(P=0.000,F=22570)。2.成功構建重組菌株SL7207-p Bud CE4.1-orim-Lcn2,經PCR鑒定正確。重組菌感染RAW264.7細胞Lcn2的蛋白表達量較對照組增加(P=0.000)。RT-q PCR法檢測重組菌m RNA表達較對照組明顯升高(P=0.000,F=5.281)。7H10平板上重組菌組BCG數量與空載菌組相比明顯減少(P=0.000,F=11.41)3.重組菌組與空載對照菌組相比小鼠脾組織Lcn2表達升高(P=0.000,F=4.449),重組菌組與生理鹽水組相比血清IFN-γ升高(P=0.004,F=15.27),IL12未見明顯差異(P0.05,F=2.26)。4.空載菌組、重組菌組小鼠肺荷菌量分別為6.27±0.33log10、6.21±0.29log10。空載菌組與重組菌組肺荷菌量比較無統計學差異(P0.05,F=1.30)�？蛰d菌組、重組菌組肺組織病理變化未見明顯差異。結論:1.成功構建了攜帶Lcn2基因的重組減毒沙門菌。2.重組菌感染RAW264.7細胞后Lcn2的表達增加,對感染RAW264.7的BCG存活起到一定的抑制作用。3.重組菌以灌胃的方式感染小鼠后,小鼠脾組織Lcn2表達增加,血清IFN-γ含量增加,血清IL-12含量未見明顯變化,提示小鼠免疫狀態(tài)有利于結核病轉歸。4.重組菌治療BCG感染小鼠后,小鼠肺部BCG荷菌量與對照組無明顯差異,肺部病理變化無明顯差異。
【圖文】：

1.DNA 標準（DL2000）;2.PCR 產物 1.DNA 標準（DL200）;2、3.雙酶A.PCR 產物瓊脂糖凝膠電泳 pBudCE4.1-orim-Lcn2B.酶切鑒定圖 1 pBudCE4.1-orim-Lcn2 質粒鑒定Fig.1 Identification of the pBudCE4.1-orim-Lcn2 plasmid2 重組質粒 pBudCE4.1-orim-Lcn2 的測序結果將酶切鑒定正確的重組質粒 pBudCE4.1-orim-Lcn2 送至成都擎科生物技術公司進行測序，結果顯示重組質粒構建成功（圖 2）。

圖 2 重組 pBudCE4.1-orim-Lcn2 的測序鑒定Fig.2 Sequencing result of the recombinant plasmid of pBudC2 在 RAW264.7 細胞中的表達水平分析△Ct比較 Lcn2 mRNA 相對表達水平，以空載體質粒 L結果顯示重組質粒、空載體質粒、空白對照的組織表1.18、1.005±0.074、0.6904±0.0262（P=0.000，，F=2257對照組（圖 3）。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R378

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 徐文玲;張博倫;張晶;;減毒沙門氏菌應用于免疫缺陷宿主的安全性檢測[J];南京大學學報(自然科學);2018年05期

2 周靜;周洲;吳瑩;向廷秀;姜政;王丕龍;;重組人脂聯素基因在減毒沙門氏菌中的表達[J];第四軍醫(yī)大學學報;2009年22期

3 黃小波;曹三杰;文心田;楊恒;;減毒沙門氏菌載體及其在疫苗研究中的應用進展[J];中國人獸共患病學報;2008年05期

4 徐引弟;郭愛珍;陳煥春;;減毒沙門氏菌載體的研究進展[J];畜牧獸醫(yī)科技信息;2007年12期

5 李正;程相朝;;減毒沙門氏菌在疫苗和疫苗載體方面的研究進展[J];中國畜牧獸醫(yī);2012年01期

6 龔建森;劉學賢;呂曉娟;;減毒沙門氏菌的研究動態(tài)及其在家禽業(yè)中的應用[J];家禽科學;2006年12期

7 朱冰,錢鋒,潘衛(wèi)慶;減毒沙門氏菌——真核質粒的導入載體[J];中國人獸共患病雜志;2001年02期

8 王龍妹;余傳霖;吳建和;;以減毒沙門氏菌作為重組疫苗載體的研究進展[J];國外醫(yī)學(微生物學分冊);1993年06期

9 張明亮;張春杰;程相朝;;沙門氏菌減毒及其作為疫苗活載體的研究進展[J];生物學雜志;2012年02期

10 白光春;減毒沙門氏菌用作重組口服活疫苗載體的研究[J];微生物學免疫學進展;1998年04期

相關會議論文 前10條

1 黃小波;文心田;曹三杰;楊恒;;減毒沙門氏菌載體及其在疫苗研究中的應用進展[A];第二屆全國人畜共患病學術研討會論文集[C];2008年

2 焦新安;潘志明;張曉明;耿士忠;胡青海;劉秀梵;;基于減毒沙門氏菌運送系統的基因工程疫苗研究進展[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會第七屆全國會員代表大會暨第十三次學術研討會論文集（上冊）[C];2009年

3 舒鄧群;王開云;曾檢華;魏金剛;吳紅翔;;以減毒沙門氏菌為載體的生長抑素基因疫苗對肉用雞血漿生化指標的影響[A];中國畜牧獸醫(yī)學會2009學術年會論文集（下冊）[C];2009年

4 周碧君;朱時杰;文明;王開功;程振濤;殷俊磊;;山羊痘重組沙門菌S7207/pVAX1-P32安全性及穩(wěn)定性的研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學會2013年學術年會論文集[C];2013年

5 哈小琴;胡明泰;呂同德;唐瑜;昌業(yè)偉;;攜帶NK4與IL-2基因的重組減毒沙門氏菌對小鼠腫瘤的防治作用[A];2008心血管藥理學術研討會論文匯編[C];2008年

6 王曉利;李銀聚;程相朝;張春杰;吳庭才;廖成水;胡阿勇;;減毒沙門氏菌介導的apo-tPA融合基因在雞體組織的分布與表達[A];中國畜牧獸醫(yī)學會禽病學分會第十五次學術研討會論文集[C];2010年

7 張靈;田勇;李揚;賈慧婕;汲坤;李馨;徐德啟;趙雪儉;;減毒沙門氏菌運載Stat3-shRNA質粒靶向治療小鼠肝原位移植瘤研究[A];中國病理生理學會第九屆全國代表大會及學術會議論文摘要[C];2010年

8 熊朝麗;張華;程振濤;周碧君;王開功;文明;;攜帶pVAX1-GPV-P32重組減毒沙門氏菌誘導山羊免疫應答研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會第八屆全國會員代表大會暨第十五次學術研討會論文集[C];2013年

9 覃宗華;蔡建平;謝明權;葉秀華;王佩瑤;陳聞;;雞艾美耳球蟲抗原基因在減毒沙門氏菌的共表達及免疫效果研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學會2004學術年會暨第五屆全國畜牧獸醫(yī)青年科技工作者學術研討會論文集（下冊）[C];2004年

10 覃宗華;蔡建平;謝明權;葉秀華;王佩瑤;陳聞;;雞艾美耳球蟲抗原基因在減毒沙門氏菌的共表達及免疫效果研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜寄生蟲學分會第五次代表大會暨第八次學術研討會論文集[C];2004年

相關博士學位論文 前10條

1 姜廣水;抗變形鏈球菌表面蛋白抗原唾液結合區(qū)段防齲疫苗實驗研究[D];山東大學;2005年

2 胡青海;雞IL-2、IL-18、IFN-γ和CpG DNA在減毒沙門氏菌運送H5亞型禽流感核酸疫苗中的佐劑作用及雞CD4和CD8分子單克隆抗體的研制[D];揚州大學;2005年

3 戴賢君;減毒沙門氏菌為載體的生長抑素DNA疫苗構建、表達及對草魚生長影響研究[D];浙江大學;2005年

4 John M.Dikki;減毒沙門氏菌為載體的原核與真核表達和雞新城疫病毒表面糖蛋白基因免疫研究[D];浙江大學;2005年

5 金春暉;減毒沙門氏菌為載體的CEACAM6聯合4-1BBL基因疫苗對大鼠腸癌生長的影響及機制研究[D];蘇州大學;2015年

6 陳果;減毒沙門氏菌介導的血吸蟲口服疫苗與腫瘤前藥治療[D];南京大學;2011年

7 邱立;兔病毒性出血癥病毒遺傳變異及口服疫苗的研究[D];西北農林科技大學;2012年

8 楊楠;口服減毒沙門氏菌傳遞shRNA表達載體在抗腫瘤治療中的應用及前腦特異轉錄因子Fezf2對斑馬魚多種神經元協調發(fā)育的調控[D];復旦大學;2009年

9 葉建新;減毒沙門氏菌為載體的4-1BBL基因疫苗對實驗性大腸癌生長的影響[D];蘇州大學;2009年

10 賈慧婕;減毒沙門氏菌運載共表達質粒Stat3-siRNA與Endostatin對小鼠肝細胞原位癌模型的治療作用及機理探討[D];吉林大學;2012年

相關碩士學位論文 前10條

1 唐弘;攜帶Lipocalin 2基因重組減毒沙門氏菌的構建及其對分枝桿菌生長影響的研究[D];重慶醫(yī)科大學;2019年

2 曾瑜虹;禽傳染性支氣管炎病毒N基因減毒沙門氏菌疫苗構建及免疫原性研究[D];四川農業(yè)大學;2009年

3 姜娜;一種新型減毒沙門氏菌疫苗載體的構建[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2009年

4 梁恩濤;兩株攜帶豬流行性腹瀉病毒S蛋白抗原區(qū)域的減毒沙門氏菌的構建與免疫規(guī)律研究[D];四川農業(yè)大學;2014年

5 李云云;豬乙型腦炎抗原表位的原核表達及以減毒沙門氏菌為載體的口服疫苗的免疫原性研究[D];四川農業(yè)大學;2010年

6 王君耀;旋毛蟲ES抗原43ku基因重組減毒沙門氏菌構建及其免疫保護效果評價[D];吉林農業(yè)大學;2017年

7 楊寧寧;減毒沙門氏菌介導的t-PA基因表達及生物學活性研究[D];河南科技大學;2012年

8 劉娟;減毒沙門氏菌運載重組G-LTB狂犬疫苗口服免疫小鼠的研究[D];吉林大學;2011年

9 張鑫淼;減毒沙門氏菌遞呈的TGEV S/N雙基因疫苗的口服免疫誘導規(guī)律研究[D];四川農業(yè)大學;2013年

10 張明亮;豫西地區(qū)PRRSV分子流行病學調查及重組ORF5減毒沙門氏菌的構建與鑒定[D];河南科技大學;2012年

本文編號：2673784