【摘要】：腸道微生物是人體重要的“消化器官”,它和胃腸道相互影響密切并且具有共同進(jìn)化的共生關(guān)系�？股卮罅繎�(yīng)用于多種疾病的治療,但同時(shí)也可能會(huì)導(dǎo)致腸道微生物群生態(tài)失調(diào)如關(guān)鍵菌群的缺失、致病菌增多、多樣性降低和代謝機(jī)能改變等,進(jìn)而引發(fā)腸道疾病的產(chǎn)生,如抗生素相關(guān)性腹瀉、腸易激綜合征、炎癥性腸病和偽膜性腸炎等,甚至可能誘發(fā)相關(guān)代謝、免疫疾病如抗生素相關(guān)性肥胖、過敏、哮喘、糖尿病和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。已有研究表明,從發(fā)酵食品中分離的乳桿菌對腸道健康具有有益作用,并且對腸道的代謝和免疫具有調(diào)節(jié)功能。本研究使用常見抗生素的包括氨芐青霉素、頭孢克肟和克林霉素以建立腸道菌群紊亂模型,并探究不同性質(zhì)的乳桿菌對腸道菌群、代謝、腸道屏障和免疫的調(diào)節(jié)功能且深入探究其作用機(jī)理,為益生菌的功能性開發(fā)提供相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:首先通過給小鼠灌胃抗生素(氨芐青霉素、低劑量頭孢克肟、高劑量頭孢克肟、克林霉素)建立腸道菌群紊亂模型,基于小鼠腸道菌群16S rRNA基因測序表明4種抗生素暴露均導(dǎo)致小鼠微生物群落多樣性以及菌群的組成、結(jié)構(gòu)和相對豐度的改變,從而引發(fā)小鼠腸道生態(tài)和功能失調(diào)。利用熱圖分析和LEfSe算法分析得到氨芐青霉素導(dǎo)致的腸道菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)中顯著改變的關(guān)鍵菌群特征,即相對豐度增加的克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、厭氧支原體屬(Anaeroplasma)、腸球菌屬(Enterococcus)和腸桿菌屬(Enterobacter),以及相對豐度顯著減少的毛螺菌科(Lachnospiraceae)和阿克曼氏菌屬(Akkermansia)。采用非量測的多維變量統(tǒng)計(jì)(NMDS)得到宿主生理和腸道菌群之間的關(guān)聯(lián),可知氨芐青霉素導(dǎo)致的菌群失調(diào)與血清中內(nèi)毒素和二胺氧化酶含量增加以及緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)下降相關(guān),建立了模擬臨床劑量抗生素導(dǎo)致的腸道生態(tài)失調(diào)的小鼠模型。其次,針對20株分離于發(fā)酵食品的乳桿菌進(jìn)行篩選,得到包括鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌和瑞士乳桿菌各5株。通過測定它們的生物學(xué)性質(zhì)包括代時(shí)、胃腸液耐受能力、糖利用情況、耐藥性、細(xì)胞粘附性和定植性等,發(fā)現(xiàn)乳桿菌的各個(gè)性質(zhì)存在種間和株間差異。不同乳桿菌在模擬胃腸道環(huán)境中的耐受能力差異很大,其中,鼠李糖乳桿菌LGG、植物乳桿菌CCFM605和CGMCC12436以及干酪乳桿菌CCFM5和CGMCC12435在模擬胃液和腸液中存活率都相對較高。小鼠體內(nèi)的定植能力測定中,鼠李糖乳桿菌CCFM492、植物乳桿菌中CCFM4、CCFM595和CGMCC12436以及干酪乳桿菌CCFM30的定植能力良好。綜合各體外性質(zhì)和體內(nèi)定植進(jìn)行主成分分析,并選取最接近主成分1和主成分2的菌株,形成兩組具有不同優(yōu)良生物特性的乳桿菌混菌組合,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。其中乳桿菌混菌A組的菌株細(xì)胞粘附率和低聚糖利用性質(zhì)優(yōu)良,而乳桿菌混菌B組中的菌株具有相對較快的生長速率以及良好的定植性和模擬腸液耐受性。評(píng)價(jià)篩選的兩組乳桿菌混菌對不同抗生素包括氨芐青霉素、頭孢克肟和克林霉素導(dǎo)致腸道菌群紊亂的修復(fù)效果,發(fā)現(xiàn)乳桿菌混菌A組(包括鼠李糖乳桿菌LGG、植物乳桿菌CCFM4、干酪乳桿菌CCFM5和瑞士乳桿菌CCFM673)和B組(包括鼠李糖乳桿菌CCFM492、植物乳桿菌CGMCC12436、干酪乳桿菌CGMCC12435和瑞士乳桿菌CCFM6)均對氨芐青霉素和高劑量頭孢克肟導(dǎo)致的腸道菌群門水平上結(jié)構(gòu)和組成紊亂有恢復(fù)作用,但兩組乳桿菌混菌對克林霉素導(dǎo)致的紊亂恢復(fù)效果不明顯。兩組乳桿菌混菌對氨芐青霉素和頭孢克肟導(dǎo)致的盲腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸降低均有顯著恢復(fù)能力,可提高其含量至正常水平,但是兩組乳桿菌混菌對克林霉素導(dǎo)致的短鏈脂肪酸水平降低的恢復(fù)效果較差。此外,乳桿菌混菌B組可以緩解高劑量頭孢克肟引發(fā)的小鼠結(jié)腸和回腸的組織損傷和炎癥至對照組水平,且可有效修復(fù)高劑量頭孢克肟導(dǎo)致的包括Mucispirillum、腸球菌屬(Enterococcus)、Alistipes和Turicibacter在內(nèi)的特定菌群相對豐度的變化。進(jìn)一步分析乳桿菌單菌株對氨芐青霉素誘導(dǎo)的腸道生態(tài)失調(diào)的菌群紊亂、代謝物改變和免疫炎癥的緩解作用,發(fā)現(xiàn)所測8株乳桿菌(來自于乳桿菌混菌A組和B組)對腸道通透性和血清內(nèi)毒素水平的恢復(fù)作用較為普遍。而其中3株菌:干酪乳桿菌CGMCC12435(LacC)、植物乳桿菌CGMCC12436(LacP)和鼠李糖乳桿菌LGG(LacG)可顯著增加結(jié)腸或回腸中部分緊密連接蛋白如ZO-1、閉合蛋白Occludin和Claudin-1的相對表達(dá)量。進(jìn)一步通過LEfSe分析表明,LacC、和LacP修復(fù)組的差異菌群數(shù)量比自然恢復(fù)組少,說明3個(gè)乳桿菌單菌組均對腸道菌群失調(diào)有顯著修復(fù)作用。但在對糞便代謝物的修復(fù)效果上3株菌具有差異,僅LacC使糞便中乙酸、丙酸和丁酸的水平顯著恢復(fù)到初始水平,并且更為有效的恢復(fù)了代謝物的整體結(jié)構(gòu)組成。LacC治療組中腸道菌群和代謝物的相關(guān)性分析表明升高的乙酸鹽水平和腸道中檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、真桿菌屬(Eubacterium)、S24-7、理研菌科(Rikenellaceae)和梭菌科(Clostridiaceae)的相對豐度增加有正相關(guān)關(guān)系。此外,LacC菌株可有效調(diào)節(jié)氨芐青霉素導(dǎo)致的結(jié)腸組織中sIgA、RegⅢγ和IFN-γ的升高,LacG可降低造模組中sIgA和RegⅢγ水平的升高,而LacP對所測免疫因子無明顯調(diào)節(jié)效果。最后,深入解析乳桿菌在代謝通路、腸道屏障和免疫調(diào)節(jié)等方面緩解抗生素導(dǎo)致生態(tài)失調(diào)的機(jī)制,結(jié)果表明LacC和LacP菌株可顯著緩解氨芐青霉素使用后結(jié)腸內(nèi)NF-κB水平的升高,并降低NF-κB p65的免疫熒光表達(dá)量,因此這2株菌可通過NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)結(jié)腸內(nèi)氨芐青霉素導(dǎo)致的免疫炎癥。在Caco-2細(xì)胞中通過Transwell構(gòu)建腸道屏障體系,并使用LPS刺激以探究抗生素作用機(jī)制,結(jié)果表明乳桿菌LacC和LacP對LPS刺激導(dǎo)致的TEER值下降即腸道屏障破壞的保護(hù)效果不明顯,但能夠調(diào)節(jié)丁酸受體GPR109A的基因表達(dá)上調(diào)以激活Toll樣受體4信號(hào)。根據(jù)全基因組分析推測了其中一株植物乳桿菌CGMCC12436的潛在功能性基因,發(fā)現(xiàn)其中參與編碼莢膜多糖合成的cpsD基因簇,這可能與它良好的腸道適應(yīng)性和功能活性有關(guān)。
【圖文】：

圖 1-1 抗生素對腸道微生物、代謝、腸道屏障和免疫的影響Fig. 1-1 The impact of antibiotics on the microbiota, metabolites and immunity.2.4 抗生素使用導(dǎo)致的生態(tài)失調(diào)和腸道疾病近期研究表明抗生素的使用對腸道微生物和相關(guān)疾病有影響，健康人體服用抗生周或更少后，菌群多樣性降低并且特定科或?qū)傧�，抗生素抗性基因上調(diào)，且這種持續(xù) 6 個(gè)月到 2 年[91]�？股剡�可能導(dǎo)致嬰兒和成人的過敏和代謝綜合征，有研究

第二章 抗生素導(dǎo)致的腸道功能失衡與評(píng)價(jià)模型建立2.4 結(jié)果與討論2.4.1 不同抗生素對小鼠體重的影響如圖 2-1 所示，在造模 14 天時(shí)，，氨芐青霉素組、高劑量頭孢克肟組和克林霉素組中小鼠體重都顯著低于對照組小鼠體重（P 值分別為 P<0.05，P<0.001，P<0.05）。而低劑量頭孢克肟組在灌胃 12 天時(shí)體重顯著降低（P<0.05），但 14 天時(shí)并無顯著差異。其中，高劑量頭孢組體重下降較為劇烈，在灌胃 4 天時(shí)已經(jīng)顯著下降（P<0.01）。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R37

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2672953