【摘要】：背景:間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是一種多能干細(xì)胞,除了能分化為脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞,還具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能。炎癥反應(yīng)期間的各種信號刺激分子是MSCs發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)能力的必要條件,并決定了MSCs免疫調(diào)節(jié)的命運(yùn)。已有研究揭示MSCs的免疫調(diào)節(jié)有著很強(qiáng)的可塑性,這樣的可塑性依賴于免疫細(xì)胞與MSCs之間通過細(xì)胞因子、趨化因子和一些小分子物質(zhì)形成的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。IFN-γ是一種主要由T細(xì)胞分泌的重要促炎因子,在一定濃度下可誘導(dǎo)MSCs產(chǎn)生抗炎因子(IDO、PD-L1等)抑制炎癥反應(yīng)。除此之外,我們還發(fā)現(xiàn)IFN-γ誘導(dǎo)的MSCs發(fā)生了糖代謝變化,由此可推斷MSCs的免疫調(diào)節(jié)和糖代謝有著潛在的相關(guān)關(guān)系,且未見與此有關(guān)的任何報導(dǎo)。Warburg效應(yīng)由德國生化學(xué)家Warburg于1920年發(fā)現(xiàn)并提出,即肝癌細(xì)胞糖酵解異常,表現(xiàn)為葡萄糖攝取率高,糖酵解活躍,并產(chǎn)生大量乳酸代謝產(chǎn)物,代謝特征為有氧糖酵解。目前已證實(shí),大多數(shù)腫瘤細(xì)胞在糖代謝方面均表征為此效應(yīng)。另外,已證實(shí)巨噬細(xì)胞向M2極化的過程中也發(fā)生了代謝變化,糖代謝的關(guān)鍵調(diào)控酶PDK1參與調(diào)控巨噬細(xì)胞的極化,當(dāng)PDK1被敲低時,促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化。干細(xì)胞靜息狀態(tài)時以糖酵解為主要代謝途徑,而IFN-γ誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)型MSCs是否發(fā)生代謝重編程,以及這種變化對其免疫調(diào)節(jié)功能的影響仍不甚清楚。因此,本研究旨在探討糖代謝在MSCs免疫調(diào)節(jié)能力可塑性中的作用及其分子機(jī)制,并為臨床上改善MSCs治療效果提供依據(jù)。目的:本課題擬從分子機(jī)制和功能上對糖代謝方式轉(zhuǎn)換與MSCs免疫調(diào)節(jié)能力的關(guān)系進(jìn)行研究。一方面明確具體關(guān)系,以及糖代謝方式轉(zhuǎn)換是否影響MSCs分泌抗炎因子;另一方面從功能上驗(yàn)證此關(guān)系,研究糖代謝方式轉(zhuǎn)換對MSCs免疫調(diào)節(jié)能力的影響是否反映在對T細(xì)胞增殖的抑制上。方法:使用si PDHA1(丙酮酸脫氫酶α1亞基)處理MSCs,制備有氧氧化缺陷型MSCs。Seahorse、混合淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測經(jīng)過或未經(jīng)過IFN-γ處理的MSCs的糖代謝狀態(tài)及其對T細(xì)胞的抑制效應(yīng),qPCR檢測經(jīng)過或未經(jīng)過IFN-γ處理的MSCs的IDO和PD-L1在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá),Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測經(jīng)過或未經(jīng)過IFN-γ處理的野生型或有氧氧化缺陷型MSCs的IDO和PD-L1的蛋白表達(dá)、以及添加ATP后經(jīng)IFN-γ刺激的有氧氧化缺陷型MSCs的IDO和PD-L1的表達(dá)。結(jié)果:經(jīng)IFN-γ誘導(dǎo)的MSCs表現(xiàn)出糖酵解減弱,氧化磷酸化增強(qiáng),IDO和PD-L1表達(dá)上調(diào),以及抑制T細(xì)胞增殖能力的提高。而si PDHA1處理能夠顯著削弱上述生物學(xué)現(xiàn)象,同時降低了MSCs的ATP水平,在此基礎(chǔ)上回補(bǔ)ATP能夠部分逆轉(zhuǎn)其效應(yīng),從而恢復(fù)抗炎功能。結(jié)論:1.IFN-γ能誘導(dǎo)MSCs向抗炎表型轉(zhuǎn)化,同時發(fā)生代謝重編程,糖酵解減弱,氧化磷酸化增強(qiáng);2.PDH依賴于ATP參與調(diào)節(jié)IFN-γ誘導(dǎo)的MSCs免疫調(diào)節(jié)能力的可塑性。
【圖文】：

圖 1 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定（A: 正常培養(yǎng)的 hUC-MSCs; B~D: hUC-MSCs 的成脂、成骨和成軟骨分化(依次為油紅 O素紅和阿爾新藍(lán)染色)；E: 流式細(xì)胞儀檢測干細(xì)胞表面標(biāo)志物 CD29、CD34、CD44、CD45、CD CD105。）2.1.2.2 IFN-γ 誘導(dǎo) MSCs 發(fā)生代謝重編程20ng/ml IFN-γ 刺激 MSCs 1h、6h、12h、24h 后，使用不同代謝檢測藥物進(jìn)行有謝及糖酵解檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MSCs 經(jīng) IFN-γ 刺激，確實(shí)發(fā)生了代謝重編程CR（氧耗率）值升高，ECAR（產(chǎn)酸率）值降低，，除 IFN-γ 刺激 1h 組（P＞0.05）有顯著差異（P＜0.05），說明氧化磷酸化作用增強(qiáng)，基礎(chǔ)呼吸和最大呼吸均增強(qiáng)酵解作用減弱。

16圖 2IFN-γ 誘導(dǎo) MSCs 發(fā)生代謝重編程（A-D：IFN-γ 處理 MSCs 1h、6h、12h、24h 的有氧代謝變化；E-H：IFN-γ 處理 MSCs 1h、6h、12h、24h 的糖酵解變化；I-L：IFN-γ 處理 MSCs 1h、6h、12h、24h 的基礎(chǔ)呼吸和最大呼吸；M-N：IFN-γ 處理 MSCs 1h、6h、12h、24h 的糖酵解水平。ns 無顯著差異，* P＜0.05, ** P＜0.01，*** P＜0.001、**** P＜0.0001，n=3。）
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R392

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本文編號：2673029