【摘要】：目的:血小板輸注是臨床上提升患者血小板數(shù)目、阻止大量出血的最主要的治療手段。目前,僅靠志愿者捐獻(xiàn)的血小板已經(jīng)無(wú)法滿足臨床上血小板需求量的持續(xù)增加。利用干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化產(chǎn)生的巨核細(xì)胞有望成為捐獻(xiàn)來(lái)源血小板的替代產(chǎn)品應(yīng)用于臨床,以緩解血小板資源緊張的現(xiàn)狀。本課題提出建立一個(gè)高效率、大規(guī)模生產(chǎn)巨核細(xì)胞的平臺(tái),獲得大量安全有效的巨核細(xì)胞供臨床患者使用。方法:1.建立CD34+造血干/祖細(xì)胞體外高產(chǎn)量、高純度產(chǎn)生巨核細(xì)胞的培養(yǎng)體系。分離臍帶血CD34+細(xì)胞,通過比較包含不同細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和小分子化合物的因子組合刺激CD34+細(xì)胞擴(kuò)增以及定向巨核系分化的效果,確定最佳的因子組合并優(yōu)化培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)以實(shí)現(xiàn)巨核細(xì)胞的體外高效生產(chǎn)。2.實(shí)現(xiàn)巨核細(xì)胞的大規(guī)模生產(chǎn)并對(duì)獲得的巨核細(xì)胞進(jìn)行特性鑒定。利用2L容積的滾瓶結(jié)合旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)建立巨核細(xì)胞中試生產(chǎn)平臺(tái)。培養(yǎng)末期,利用瑞氏吉姆薩染色對(duì)巨核細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定;細(xì)胞免疫熒光染色分析細(xì)胞特異性標(biāo)志物的表達(dá)情況;碘化吡啶染色結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)巨核細(xì)胞的多倍體含量;實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)巨核細(xì)胞分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)水平。3.在小鼠和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型中評(píng)價(jià)巨核細(xì)胞的體內(nèi)安全性和有效性。利用非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠模型,評(píng)價(jià)人巨核祖細(xì)胞和成熟巨核細(xì)胞的體內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)以及血小板釋放能力。動(dòng)員食蟹猴外周血CD34+細(xì)胞并運(yùn)用建立的培養(yǎng)體系產(chǎn)生食蟹猴巨核祖細(xì)胞和成熟巨核細(xì)胞,通過注射化療藥物卡鉑建立食蟹猴骨髓抑制性血小板減少癥模型,并進(jìn)行巨核祖細(xì)胞以及成熟巨核細(xì)胞的移植,評(píng)價(jià)其體內(nèi)安全性及提升血小板數(shù)目的有效性。結(jié)果:1.經(jīng)過多輪篩選及優(yōu)化,獲得了促進(jìn)CD34+細(xì)胞擴(kuò)增以及巨核系定向分化的最佳因子組合,建立了無(wú)血清、無(wú)基質(zhì)成分、不涉及基因操作的“二步法”培養(yǎng)體系,實(shí)現(xiàn)了巨核細(xì)胞的高產(chǎn)量、高純度生產(chǎn)。1個(gè)臍帶血CD34+細(xì)胞通過該培養(yǎng)體系體外培養(yǎng)6+7天,可以產(chǎn)生約1.0×104個(gè)巨核系細(xì)胞(CD41a+和CD42b+細(xì)胞的純度分別為82.4%± 6.1%和73.3%± 8.5%),比之前文獻(xiàn)報(bào)道的巨核細(xì)胞產(chǎn)量高30～650 倍。2.利用滾瓶旋轉(zhuǎn)體系建立的中試生產(chǎn)平臺(tái)實(shí)現(xiàn)了巨核細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)�；a(chǎn),并且進(jìn)一步提高巨核細(xì)胞的產(chǎn)量約2倍。形態(tài)學(xué)研究顯示,培養(yǎng)獲得的成熟巨核細(xì)胞胞體巨大,平均直徑達(dá)到29.1 ±4.6 μm,并且有明顯的前血小板絲狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。DNA多倍體含量檢測(cè)表明,獲得的巨核細(xì)胞中4倍體占19.63%±1.81%,8倍體占11.13%±1.52%,16倍體及以上占4.00%±0.54%。RT-qPCR研究顯示,誘導(dǎo)分化末期GATA-1、FOG-1、NF-E2 以及β-tubulin mRNA的表達(dá)水平顯著增加,在分子水平上證明了巨核細(xì)胞的分化和成熟。3.在NOD/SCID小鼠模型中,移植的人巨核祖細(xì)胞能夠歸巢到骨髓并持續(xù)產(chǎn)生血小板;移植的成熟巨核細(xì)胞大部分在小鼠肺部截留,0.5～3小時(shí)(h)熒光信號(hào)最強(qiáng),同時(shí)可在小鼠外周血中檢測(cè)到人源血小板,于6～8h達(dá)到峰值,隨后逐漸下降。在食蟹猴骨髓抑制性血小板減少癥模型中,自體移植巨核祖細(xì)胞能夠提升血小板計(jì)數(shù)最低值并且促進(jìn)造血系統(tǒng)的恢復(fù);自體或同種異體移植成熟巨核細(xì)胞3h后可以在食蟹猴外周血中檢測(cè)到功能性血小板的產(chǎn)生,持續(xù)48h。此外,實(shí)驗(yàn)進(jìn)行及完成后12個(gè)月的觀察期顯示,所有動(dòng)物健康狀況良好,無(wú)任何異常及腫瘤的形成,證實(shí)“二步法”培養(yǎng)體系產(chǎn)生的巨核細(xì)胞具有長(zhǎng)期的體內(nèi)安全性。結(jié)論:本研究提出的“二步法”培養(yǎng)體系和中試規(guī)模生產(chǎn)平臺(tái)能夠在體外高產(chǎn)量、高效率地誘導(dǎo)造血干細(xì)胞產(chǎn)生功能性巨核細(xì)胞,為臨床上血小板減少癥的治療提供了新思路。
【圖文】：

組合ＳＦＴ３邋（ＳＣＦ、Ｆｌｔ３－Ｌ、ＴＰＯ、ＩＬ－３）促進(jìn)人臍帶血造血干／祖細(xì)胞體外擴(kuò)增及ＣＤ３４逡逑陽(yáng)性率保持的效果。初始接種細(xì)胞數(shù)量為４ｘｌ0４，ＣＤ３４＋細(xì)胞陽(yáng)性率為９４．２％±３．５°／0。逡逑結(jié)果如圖１所示，在培養(yǎng)的前三天，各組細(xì)胞X椫車乃俁榷急冉匣郝�，但首l擁冢沖義咸煒跡赴┰齔拭饗緣納仙魘�。其中，因子组合哑Ｔ３和哑Ｔ３＋ＬＤＬ磧喐胞辶x顯鮒車男Ч嗨�，哉斷养第６虩碗A櫚淖芟赴糠直鷂保擔(dān)歟埃，

本文編號(hào)：2671697