【摘要】：目的:通過高效氯氰菊酯脅迫遵義地區(qū)岡田繞眼果蠅(Phortica okadai,P.okadai),研究其細(xì)胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)基因的表達(dá)特征,為媒介昆蟲對菊酯類殺蟲劑的代謝抗性機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。方法:1.建立P.okadai動物模型:在遵義周邊地區(qū)誘捕P.okadai,形態(tài)學(xué)初步鑒定后進(jìn)行實驗室飼養(yǎng),進(jìn)一步通過體視鏡、掃描電鏡等對其卵、幼蟲、蛹、成蟲四個階段進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究,并利用細(xì)胞色素C氧化酶亞基1(cytochrome c oxidase subunit 1,cox1)基因進(jìn)行分子鑒定。2.高效氯氰菊酯脅迫下P.okadai的毒力測定:參照GB/T26350-2010版《蠅類抗藥性檢測方法家蠅生物測定法》,通過藥膜法檢測高效氯氰菊酯對P.okadai(實驗室飼養(yǎng)未接觸任何殺蟲劑、羽化3-5 d未交尾的雌蠅)的毒力。3.內(nèi)參基因篩選:結(jié)合課題組前期構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,挑選18S RNA、EF-1α、GAPDH、β-Actin和β-Tublin五個候選內(nèi)參基因,通過熒光定量PCR檢測,結(jié)合△Ct值分析、GeNorm軟件分析、NormFinder軟件分析和BestKeeper分析四種方法,確定P.okadai在高效氯氰菊酯脅迫下表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因。4.結(jié)合課題組前期構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,挑選四個與對菊酯類殺蟲劑代謝抗性相關(guān)的CYP450基因,以篩選到的β-Tublin基因作為內(nèi)參基因,通過熒光定量PCR分析候選CYP450基因在高效氯氰菊酯LC_(20)(0.061mg/L)脅迫下七個時間點(0、1、2、4、8、12、24 h)的表達(dá)差異。5.高效氯氰菊酯脅迫下P.okadai CYP450酶系基因表達(dá)差異研究:通過轉(zhuǎn)錄組測序比較P.okadai在高效氯氰菊酯作用0 h和1 h CYP450酶系基因的表達(dá)差異,并挑選部分CYP450基因進(jìn)行熒光定量PCR驗證。結(jié)果:1.遵義地區(qū)P.okadai與中國安徽等其他地區(qū)P.okadai形態(tài)學(xué)上無明顯差異,二者cox1基因序列一致性為100%;與歐美的變色伏繞眼果蠅(Phortica variegata,P.variegata)形態(tài)學(xué)上無明顯差異,與意大利P.variegata的cox1基因序列一致性為98%。2.毒力回歸計算結(jié)果表明,高效氯氰菊酯作用于P.okadai的LC_(20)為0.061 mg/L。3.熒光定量PCR結(jié)果顯示,五個候選內(nèi)參基因中,β-Tublin基因是高效氯氰菊酯脅迫研究的最適內(nèi)參基因。4.熒光定量PCR結(jié)果表明,四個CYP450基因均在脅迫1 h時就出現(xiàn)顯著表達(dá)差異(P0.05),其中cyp9f2基因表達(dá)顯著升高,其他三個基因表達(dá)顯著降低。5.轉(zhuǎn)錄組測序分析顯示高效氯氰菊酯脅迫P.okadai 1 h時,差異表達(dá)的CYP450基因有103個。以差異倍數(shù)|log_2~(Ratio)|≥1和q值0.05為標(biāo)準(zhǔn),篩選出差異表達(dá)的CYP450基因有21個,其中表達(dá)上調(diào)基因5個,表達(dá)下調(diào)基因16個;熒光定量PCR驗證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致。結(jié)論:1.遵義地區(qū)P.okadai與P.variegata形態(tài)學(xué)上一致,但基于cox1基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示二者存在一定差異。2.高效氯氰菊酯脅迫下P.okadai的LC_(20)為0.061 mg/L,表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因是β-Tublin基因。3.低濃度高效氯氰菊酯脅迫1 h以內(nèi),P.okadai對殺蟲劑的代謝可能與cyp28d1、cyp28d2、cyp4d2以及cyp49a1等CYP450基因表達(dá)上調(diào)相關(guān)。
【圖文】：

科大學(xué)碩士學(xué)位論文 驗方法外誘捕。組前期調(diào)查 T. callipaeda 患者主要分布在遵義地區(qū)的正安、綏國貴州省遵義市，27°13'15″-28°04'09″N ，106°17'22″-107°26'2有感染病例，該地區(qū)的海拔高度在 800 至 1300 米之間（圖 1-1）遵義市紅花崗區(qū)董公寺鎮(zhèn)匯川國際溫泉城附近梨園，參考王增 2×1×1 cm 大小果塊兒于 20-30 ℃環(huán)境自然發(fā)酵"g24 h，倒出果包，懸掛于距離地面 1 m，待蠅子前來覓食時用提前用紗布和果包一同取下，等待鑒定。

蠅（圖 1-2），停落時呈長橢圓形的雙翅重腹果蠅相比明顯較大，較易區(qū)別。復(fù)眼周邊（圖 1-3A）；胸背部多個褐色暗斑（圖 1-于中央和側(cè)緣向前延伸，形成“山”字形（圖分枝毛較短（圖 1-3D）；雌、雄蠅皆具一對衡棒，翅瓣較小，前翅亞前緣脈退化，有 三與第四縱脈，第四與第五縱脈，，中部具有色環(huán)帶（圖 1-3G）; 雄蠅果蠅腹部分 10連的側(cè)臂組成，外生殖器位于腹側(cè)后端（圖的端突與基突，形成似手握之半環(huán)形（圖 1-3J）。義地區(qū)分布的 P. okadai，經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)王研究的 A. okadai (P. okadai)在形態(tài)學(xué)上一致
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R384.2

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2 ;歐盟禁止使用農(nóng)藥高效氯氰菊酯[J];中國食品衛(wèi)生雜志;2017年05期

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本文編號：2668755