【摘要】：目的:近年來ZIKV疫情在全球多個國家和地區(qū)的爆發(fā)引起了人們的極大關注。在流行疫區(qū),受感染人群中新生兒小頭畸形癥和成人格林-巴利綜合征的比例顯著增加,表明其可能具有嚴重的神經毒性。然而目前還沒有疫苗或特效藥物可以針對性的預防或治療ZIKV感染引起的疾病,因此明確ZIKV的發(fā)病機制迫在眉睫。有研究指出ZIKV不能引起機體產生快速而強烈的天然免疫反應,提示ZIKV可以通過某種策略逃避宿主細胞的抗病毒免疫反應。目前在探究寨卡病毒免疫逃逸機制方面取得了一定進展,但關于介導寨卡免疫逃逸的病毒蛋白及其分子機制尚未完全闡明。此外,ZIKV非洲系和亞洲系兩大世系間基因序列存在差異性,這種差異可能使其與宿主之間產生了新型且多樣的相互作用,從而表現(xiàn)出獨特的先天免疫應答和致病性。然而相比于以MR766為代表的非洲病毒株,當代亞洲系病毒株研究較少。本課題以2016年從中國廣州輸入的當代亞洲株SZ-WIV01為對象,研究其逃避宿主天然免疫的分子機制。方法:1.SH-SY5Y細胞系被SZ-WIV01寨卡病毒株感染后,通過RT-PCR及ELISA實驗探究SZ-WIV01對I型IFN(IFNβ)的抑制作用。2.構建SZ-WIV01病毒株3種結構蛋白(C,M,E)、7種非結構蛋白(NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS2B3,NS4A,NS4B,NS5)以及蛋白酶復合體NS2B3的真核表達質粒并瞬時轉染入HEK293T細胞中,通過Western Blot實驗驗證其在真核細胞中的表達情況。3.將病毒蛋白表達質粒分別瞬轉入HEK293T細胞中,通過RT-PCR、雙熒光素酶報告實驗等技術檢測其對IFNβ及CCL5、ISG15等干擾素刺激基因的抑制情況,以篩選出參與SZ-WIV01免疫逃逸過程的關鍵病毒蛋白。4.構建RLRs信號通路中RIG-I、MAVS、MITA、TBK1、IRF3等主要作用元件及其激活體的真核表達質粒,通過RT-PCR、ELISA、Western Blot、免疫共沉淀、免疫共聚焦等實驗技術探究SZ-WIV01及其病毒蛋白對RLRs通路中的各蛋白的影響,以初步確定可與病毒蛋白相互作用的通路靶蛋白。5.根據功能分區(qū),構建病毒蛋白及通路靶蛋白的截短體或點突變體,Western Blot實驗驗證其在真核細胞中的表達情況,通過免疫共沉淀實驗探究病毒蛋白與通路靶蛋白相互作用的具體結合區(qū)域。6.通過RT-PCR、Western Blot等探究SZ-WIV01及其病毒蛋白對通路靶蛋白表達的影響。7.通過Western Blot、泛素化等實驗探究SZ-WIV01及其病毒蛋白對通路靶蛋白泛素化等翻譯后修飾的影響。結果:1.SZ-WIV01病毒可以顯著抑制IFNβ及其下游ISGs的產生,以逃避宿主天然抗病毒免疫反應。2.所構建SZ-WIV01病毒株各蛋白、RLRs通路各蛋白及其截短體質粒在真核細胞中成功表達。3.SZ-WIV01非結構蛋白NS3和NS2B3顯著抑制poly(I:C)誘導的IFNβ、ISGs表達以及IRF3蛋白的核易位過程。4.NS3和NS2B3病毒蛋白分別通過靶向并結合MAVS和MITA蛋白來抑制RLRs通路信號傳遞,發(fā)揮其干擾素拮抗作用。5.NS3與MAVS的結合依賴于NS3(aa 181-480)和MAVS(aa1-180)或(aa361-540),而NS2B3(aa1-310)與MITA(aa1-379)發(fā)生蛋白相互作用。6.NS3和NS2B3分別特異性的抑制MAVS和MITA的蛋白表達。進一步的截短體實驗表明,過表達NS3時,MAVS(aa 361-540)發(fā)生表達下調,而MAVS(aa 1-180)和MAVS(aa 181-360)則能夠避免這種抑制作用。同時NS2B3的過表達可以明顯下調MITA-C(aa 174-379)蛋白表達,但對MITAN(aa 1-173)影響不大。7.NS3和NS2B3分別在蛋白水平而非m RNA水平調控MAVS和MITA的表達。同時蛋白酶體抑制劑MG132顯著逆轉了這種抑制,表明這一過程主要由蛋白酶體途徑介導。8.NS3和NS2B3分別通過催化MAVS和MITA的K48泛素化修飾來促進其發(fā)生降解。9.NS2B3還可通過下調MITA的K63泛素化修飾來抑制RLRs通路信號的傳遞。結論:ZIKV病毒株SZ-WIV01能拮抗I型IFN及ISGs的產生并對MAVS和MITA的表達產生抑制作用。機制上,SZ-WIV01的病毒蛋白NS3和NS2B3可分別靶向并結合MAVS和MITA蛋白,并依賴K48介導的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)促使它們發(fā)生降解。此外,NS2B3可通過抑制MITA的K63泛素化修飾來負反饋調節(jié)RLRs通路的信號傳導,從而拮抗I型IFN的產生。我們的研究揭示了ZIKV逃避先天免疫反應的未被發(fā)現(xiàn)的機制,為疫苗或有效藥物的臨床研究提供新的見解。
【圖文】：

圖 1. SZ-WIV01 寨卡病毒株顯著抑制 IFNβ 及 ISGs 的表達 (A) SH-SY5Y 細胞經 SZ-WIV01 病毒(1 MOI)感染 3 h 后，去除病毒接種物并洗滌后更換新鮮的 DMEM 高糖培養(yǎng)基繼續(xù)孵育，，分別于 24 h 48 h 及 72 h 后收取細胞上清 以 Vero 細胞為媒介做標準病毒噬斑實驗，檢測細胞上清液中病毒滴度值 滴度表達單位為 pfu /ml

華 中 科 技 大 學 博 士 學 位 論 文核細胞中正常表達(圖 2-1) 其中，NS2B3 病毒蛋白被檢測出含有三條大小的條帶 這是由于 NS2B3 具有蛋白酶活性，可對自身進行酶切，這也從側實了此次構建的 NS2B3 蛋白成功保留了其蛋白酶生物學功能
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R392

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