【摘要】：目的:近年來(lái)ZIKV疫情在全球多個(gè)國(guó)家和地區(qū)的爆發(fā)引起了人們的極大關(guān)注。在流行疫區(qū),受感染人群中新生兒小頭畸形癥和成人格林-巴利綜合征的比例顯著增加,表明其可能具有嚴(yán)重的神經(jīng)毒性。然而目前還沒(méi)有疫苗或特效藥物可以針對(duì)性的預(yù)防或治療ZIKV感染引起的疾病,因此明確ZIKV的發(fā)病機(jī)制迫在眉睫。有研究指出ZIKV不能引起機(jī)體產(chǎn)生快速而強(qiáng)烈的天然免疫反應(yīng),提示ZIKV可以通過(guò)某種策略逃避宿主細(xì)胞的抗病毒免疫反應(yīng)。目前在探究寨卡病毒免疫逃逸機(jī)制方面取得了一定進(jìn)展,但關(guān)于介導(dǎo)寨卡免疫逃逸的病毒蛋白及其分子機(jī)制尚未完全闡明。此外,ZIKV非洲系和亞洲系兩大世系間基因序列存在差異性,這種差異可能使其與宿主之間產(chǎn)生了新型且多樣的相互作用,從而表現(xiàn)出獨(dú)特的先天免疫應(yīng)答和致病性。然而相比于以MR766為代表的非洲病毒株,當(dāng)代亞洲系病毒株研究較少。本課題以2016年從中國(guó)廣州輸入的當(dāng)代亞洲株SZ-WIV01為對(duì)象,研究其逃避宿主天然免疫的分子機(jī)制。方法:1.SH-SY5Y細(xì)胞系被SZ-WIV01寨卡病毒株感染后,通過(guò)RT-PCR及ELISA實(shí)驗(yàn)探究SZ-WIV01對(duì)I型IFN(IFNβ)的抑制作用。2.構(gòu)建SZ-WIV01病毒株3種結(jié)構(gòu)蛋白(C,M,E)、7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS2B3,NS4A,NS4B,NS5)以及蛋白酶復(fù)合體NS2B3的真核表達(dá)質(zhì)粒并瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞中,通過(guò)Western Blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其在真核細(xì)胞中的表達(dá)情況。3.將病毒蛋白表達(dá)質(zhì)粒分別瞬轉(zhuǎn)入HEK293T細(xì)胞中,通過(guò)RT-PCR、雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)等技術(shù)檢測(cè)其對(duì)IFNβ及CCL5、ISG15等干擾素刺激基因的抑制情況,以篩選出參與SZ-WIV01免疫逃逸過(guò)程的關(guān)鍵病毒蛋白。4.構(gòu)建RLRs信號(hào)通路中RIG-I、MAVS、MITA、TBK1、IRF3等主要作用元件及其激活體的真核表達(dá)質(zhì)粒,通過(guò)RT-PCR、ELISA、Western Blot、免疫共沉淀、免疫共聚焦等實(shí)驗(yàn)技術(shù)探究SZ-WIV01及其病毒蛋白對(duì)RLRs通路中的各蛋白的影響,以初步確定可與病毒蛋白相互作用的通路靶蛋白。5.根據(jù)功能分區(qū),構(gòu)建病毒蛋白及通路靶蛋白的截短體或點(diǎn)突變體,Western Blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其在真核細(xì)胞中的表達(dá)情況,通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)探究病毒蛋白與通路靶蛋白相互作用的具體結(jié)合區(qū)域。6.通過(guò)RT-PCR、Western Blot等探究SZ-WIV01及其病毒蛋白對(duì)通路靶蛋白表達(dá)的影響。7.通過(guò)Western Blot、泛素化等實(shí)驗(yàn)探究SZ-WIV01及其病毒蛋白對(duì)通路靶蛋白泛素化等翻譯后修飾的影響。結(jié)果:1.SZ-WIV01病毒可以顯著抑制IFNβ及其下游ISGs的產(chǎn)生,以逃避宿主天然抗病毒免疫反應(yīng)。2.所構(gòu)建SZ-WIV01病毒株各蛋白、RLRs通路各蛋白及其截短體質(zhì)粒在真核細(xì)胞中成功表達(dá)。3.SZ-WIV01非結(jié)構(gòu)蛋白NS3和NS2B3顯著抑制poly(I:C)誘導(dǎo)的IFNβ、ISGs表達(dá)以及IRF3蛋白的核易位過(guò)程。4.NS3和NS2B3病毒蛋白分別通過(guò)靶向并結(jié)合MAVS和MITA蛋白來(lái)抑制RLRs通路信號(hào)傳遞,發(fā)揮其干擾素拮抗作用。5.NS3與MAVS的結(jié)合依賴于NS3(aa 181-480)和MAVS(aa1-180)或(aa361-540),而NS2B3(aa1-310)與MITA(aa1-379)發(fā)生蛋白相互作用。6.NS3和NS2B3分別特異性的抑制MAVS和MITA的蛋白表達(dá)。進(jìn)一步的截短體實(shí)驗(yàn)表明,過(guò)表達(dá)NS3時(shí),MAVS(aa 361-540)發(fā)生表達(dá)下調(diào),而MAVS(aa 1-180)和MAVS(aa 181-360)則能夠避免這種抑制作用。同時(shí)NS2B3的過(guò)表達(dá)可以明顯下調(diào)MITA-C(aa 174-379)蛋白表達(dá),但對(duì)MITAN(aa 1-173)影響不大。7.NS3和NS2B3分別在蛋白水平而非m RNA水平調(diào)控MAVS和MITA的表達(dá)。同時(shí)蛋白酶體抑制劑MG132顯著逆轉(zhuǎn)了這種抑制,表明這一過(guò)程主要由蛋白酶體途徑介導(dǎo)。8.NS3和NS2B3分別通過(guò)催化MAVS和MITA的K48泛素化修飾來(lái)促進(jìn)其發(fā)生降解。9.NS2B3還可通過(guò)下調(diào)MITA的K63泛素化修飾來(lái)抑制RLRs通路信號(hào)的傳遞。結(jié)論:ZIKV病毒株SZ-WIV01能拮抗I型IFN及ISGs的產(chǎn)生并對(duì)MAVS和MITA的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用。機(jī)制上,SZ-WIV01的病毒蛋白NS3和NS2B3可分別靶向并結(jié)合MAVS和MITA蛋白,并依賴K48介導(dǎo)的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)促使它們發(fā)生降解。此外,NS2B3可通過(guò)抑制MITA的K63泛素化修飾來(lái)負(fù)反饋調(diào)節(jié)RLRs通路的信號(hào)傳導(dǎo),從而拮抗I型IFN的產(chǎn)生。我們的研究揭示了ZIKV逃避先天免疫反應(yīng)的未被發(fā)現(xiàn)的機(jī)制,為疫苗或有效藥物的臨床研究提供新的見(jiàn)解。
【圖文】：

圖 1. SZ-WIV01 寨卡病毒株顯著抑制 IFNβ 及 ISGs 的表達(dá) (A) SH-SY5Y 細(xì)胞經(jīng) SZ-WIV01 病毒(1 MOI)感染 3 h 后，去除病毒接種物并洗滌后更換新鮮的 DMEM 高糖培養(yǎng)基繼續(xù)孵育，，分別于 24 h 48 h 及 72 h 后收取細(xì)胞上清 以 Vero 細(xì)胞為媒介做標(biāo)準(zhǔn)病毒噬斑實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)細(xì)胞上清液中病毒滴度值 滴度表達(dá)單位為 pfu /ml

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文核細(xì)胞中正常表達(dá)(圖 2-1) 其中，NS2B3 病毒蛋白被檢測(cè)出含有三條大小的條帶 這是由于 NS2B3 具有蛋白酶活性，可對(duì)自身進(jìn)行酶切，這也從側(cè)實(shí)了此次構(gòu)建的 NS2B3 蛋白成功保留了其蛋白酶生物學(xué)功能
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2668568