【摘要】：細胞信號通路在細胞內部構成了一個龐大的網絡,其維持著細胞的生存和代謝,控制著細胞體的“生老病死”,因此了解細胞信號的傳遞機制能夠幫助人們探索生命運行的奧秘。細胞信號包括很多方面,其中細胞信號的強度和持續(xù)的時間對細胞功能的發(fā)揮起重要作用。胰島素信號通路作為細胞信號網絡中的重要組成部分,其調節(jié)機制錯綜復雜。胰島素誘導的胰島素受體底物1(insulin receptor substrate 1,IRS1)的降解過程作為胰島素信號通路中負反饋調節(jié)的重要組成部分,可以終止胰島素信號避免其過度激活。然而,在各種應激反應中調節(jié)IRS1穩(wěn)定性的分子機制并沒有被了解清楚。脂肪酸作為構成生命的重要元素之一,其組成了龐大的細胞膜結構,為各細胞器功能的發(fā)揮提供場所壁壘,但是其在信號傳導方面的作用并沒有被完全揭示。CD36作為許多脂質的受體,其與胰島素敏感性的關系有一定程度的研究,但是CD36對胰島素信號敏感性的具體影響存在很大爭議。我們的研究表明在C2C12肌肉細胞中缺失CD36能夠增強胰島素短時間內激活的胰島素信號,但是信號激活的持續(xù)時間變短,同時胰島素慢性刺激誘導的胰島素抵抗現象也比較嚴重。該現象可能是由于CD36敲降后胰島素誘導的IRS1降解加快所致。CD36依賴自身的泛素化修飾可以與IRS1結合,抑制CUL7(Cullin7)與IRS1的相互作用,進而降低IRS1的泛素化水平,使IRS1降解減慢,然而脂肪酸預處理可以抑制CD36在該方面的功能。同時,胰島素信號通路在腫瘤細胞的代謝過程中發(fā)揮重要作用,胰島素信號通路的強弱與癌細胞的增殖、遷移、侵襲及抗藥性都有一定關系。脂肪酸通過CD36等相關膜受體蛋白轉運進入細胞后一部分參與復合脂質的合成,另一部分經各種修飾而被賦予新的功能。許多修飾化的脂肪酸及相關的酶都可以參與到胰島素信號通路的調節(jié)過程中。我們發(fā)現脂肪酸2羥基化酶(fatty acid 2-hydroxylase,FA2H),可以通過影響胰島素信號通路中的ERK1/2正反饋調節(jié)胰島素受體(insulin receptor,IR)的表達。在乳腺癌MCF7細胞中沉默FA2H后ERK1/2磷酸化水平增加,同時IR的mRNA和蛋白水平都明顯增加,并且該細胞的增殖能力在一定程度上也有所增強。而使用ERK1/2的抑制劑U0126后,IR的蛋白和mRNA表達水平都有所下降,同時該細胞的增殖能力也有所抑制。該研究工作闡述了脂肪酸感知與修飾對胰島素信號通路的影響,為改善胰島素敏感性以及治療糖尿病和相關的癌癥等疾病提供了新的靶點。
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2.1. 敲降及過表達 CD36。A、B，C2C12 成纖維細胞接種長滿后更換含有 2%馬血清EM 培養(yǎng)基誘導肌肉細胞分化，每天換液，圖中標注 D 代表分化天數，按圖示所示分取 RNA 和蛋白質，通過 Western blot 和 Q-PCR 檢測 CD36 的蛋白（A）和 mRNA（B水平；C、D，使用 siRNA 對分化第三天的 C2C12 細胞進行干擾，干擾 24 小時候換基繼續(xù)培養(yǎng)誘導分化 3 天，肌肉細胞分化成熟后提取蛋白質（C）和 RNA（D）進行檢使用 siRNA 對分化第三天的 C2C12 細胞進行干擾，干擾 24 小時候換分化培養(yǎng)基繼續(xù)分化 3 天，對分化成熟的肌肉細胞進行拍照觀察分化效果；F，分別構建穩(wěn)轉野生型 D36-WT）、泛素化位點突變型 CD36（CD36-K/A）以及對照空質粒（vec）的 CHO 細胞蛋白檢測表達效果；誤差線代表±SD，，顯著性差異由 t 檢驗得出，*號代表 p < 0.05，號表示 p < 0.001，分別與分化第 0 天或 NC 組比較。igure 2.1. The knockdown and overexpression efficiency of CD36 in myotubes and CHO. Anfluent C2C12 myoblasts were induced to differentiation by DMEM containing 2% hrose sebel D in figure means the day(s) for differentiation, protein (A) and RNA (B) were extractedndicated times, and analyzed using Western blot and Q-PCR to detect the level of CD36. C,2C12 myotubes were treated with a scrambled negative control (NC) siRNA or siRNA targe

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