【摘要】：卵形瘧原蟲(Plasmodium ovale)是主要的人體瘧原蟲之一,主要流行于非洲,中東和東南亞等地。1992年Stevens對其進行了系統(tǒng)描述,因為鏡檢鑒別困難導致卵形瘧原蟲感染率被低估,其較輕的臨床癥狀也使其受到的關注度較少。我國目前無本地感染卵形瘧原蟲病例報告,然而隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展,勞務輸出和跨國貿(mào)易及旅游愈來愈多,輸入性卵形瘧病例呈逐年增多趨勢,主要感染來源地為非洲,因此對非洲輸入性卵形瘧原蟲的研究尤為重要。隨著抗瘧藥物的廣泛使用,全球多地區(qū)報道惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲抗藥性蟲株,卵形瘧原蟲與其共享相同的媒介與宿主,很可能受到了同樣的藥物選擇壓力。目前對抗藥性的監(jiān)測方法主要有體內(nèi)藥效試驗、體外藥敏實驗及抗性分子標記檢測。由于卵形瘧原蟲臨床病例少見,體外培養(yǎng)體系尚未建立,抗性分子標記的檢測成為了對卵形瘧原蟲抗藥性監(jiān)測最適用方法。本研究以168份非洲輸入性卵形瘧病例樣本為研究對象,選取已在其他人體瘧原蟲種中被證實的4個抗藥性基因,對卵形瘧原蟲進行這4個抗性基因的多態(tài)性及藥物選擇壓力分析,針對可能存在藥物選擇壓力的基因,進一步通過微衛(wèi)星標記分析驗證,并對其種群遺傳結(jié)構進行分析,為研究卵形瘧原蟲抗藥性監(jiān)測和進一步研究提供科學依據(jù)。本研究分為兩個部分:一、卵形瘧原蟲藥物抗性分子標記多態(tài)性分析收集江蘇省2012-2016年輸入性卵形瘧患者血樣,對卵形瘧原蟲K13,crt,cytb,dhfr基因進行PCR擴增并測序。應用BioEdit軟件對測序序列進行比對,應用DNAstar軟件分析序列的突變情況,用DnaSP軟件分析序列多態(tài)性及進行中性檢驗,應用MEGA軟件中的Nei-Gojobori法(Jukes-Cantor校對)計算非同義堿基替代率(d_N)和同義堿基替代率(d_S),并基于鄰接法構建基因遺傳進化樹。結(jié)果顯示,4個藥物抗性相關基因除dhfr基因外,多態(tài)性水平均較低。卵形瘧原蟲K13基因僅含有2個同義突變。卵形瘧原蟲crt基因柯氏亞種含有E34G,L43V突變各一例,沃氏亞種含有2例E34G突變,1例I102M,1例V111F突變,crt基因未受到正向選擇。卵形瘧原蟲cytb基因柯氏亞種和沃氏亞種都存在R66K,R75K,R95K突變,但突變率均較低,未受到正向選擇。卵形瘧原蟲dhfr基因柯氏亞種發(fā)現(xiàn)S58R和S113B/T突變,且突變率相對較高,分別達52.17%和17.39%,d_N/d_S為2.42,可能受到正向選擇;沃氏亞種含有S58R,T62R,S113T,S113N和I169T突變,但突變率均較低。二、卵形瘧原蟲藥物抗性分子標記dhfr基因側(cè)翼微衛(wèi)星多態(tài)性研究卵形瘧原蟲藥物抗性相關基因多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn),卵形瘧原蟲dhfr基因柯氏亞種突變率相對較高,可能受到正向選擇。為進一步確認是否存在藥物選擇壓力,我們對dhfr基因側(cè)翼的5個微衛(wèi)星位點進行分析,利用GenAlEx軟件計算每個群體的期望雜合度He,并檢驗He值有無統(tǒng)計學差異,判定是否存在選擇性清除。并應用Structure軟件分析卵形瘧原蟲遺傳結(jié)構,為進一步探討卵形瘧原蟲抗性蟲株的起源與傳播提供基礎依據(jù)。研究結(jié)果顯示,卵形瘧原蟲五個微衛(wèi)星位點平均等位基因個數(shù)Na為7.2。對來源不同的樣本的5個微衛(wèi)星位點的期望雜合度均值進行分析,非洲南部為0.619±0.041,非洲西部為0.678±0.036,非洲中部為0.636±0.054,三個地區(qū)He值統(tǒng)計學差異為P=0.0920.05,未發(fā)現(xiàn)顯著的統(tǒng)計學差異;對輸入來源比較多的三個國家的樣本的期望雜合度均值進行比較分析,其中安哥拉為0.612±0.038,尼日利亞為0.658±0.033,赤道幾內(nèi)亞為0.598±0.061,三個國家He值統(tǒng)計學差異為P=0.1310.05,無明顯統(tǒng)計學差異。以dhfr基因的氨基酸第58位和氨基酸第113位處的突變進行分類,S58R突變株5個位點的期望雜合度均值為0.575±0.069,S58R野生株為0.682±0.045,兩者統(tǒng)計學差異P=0.011(P0.05);S113B/T突變株5個位點的期望雜合度均值為0.511±0.074,S113B/T野生株為0.661±0.060,兩者統(tǒng)計學差異P=0.001(P0.05),野生株期望雜合度高于突變株,提示dhfr基因存在選擇性清除,可能受到了藥物選擇壓力。卵形瘧原蟲遺傳結(jié)構分析顯示,dhfr基因存在7個單體型,有3個屬于優(yōu)勢單體型,非洲南部,非洲西部與非洲中部具有共同單體型。非洲南部,西部,中部卵形瘧原蟲蟲株之間的遺傳分化系數(shù)不同,西部與中部的分化系數(shù)Fst最大為0.038,差異沒有統(tǒng)計學意義(P0.05)。不同國家之間尼日利亞和赤道幾內(nèi)亞遺傳分化系數(shù)最大,Fst為0.041,差異沒有統(tǒng)計學意義(P0.05)。S58R突變株與野生株遺傳分化為0.103(P0.05),S113B/T突變株與野生株遺傳分化為0.087(P0.05),突變株與野生株呈現(xiàn)了一定程度的遺傳分化。本研究通過對從非洲輸入的卵形瘧原蟲進行藥物抗性相關分子標記測序分析及基因側(cè)翼微衛(wèi)星標記分析,發(fā)現(xiàn)了卵形瘧原蟲dhfr基因存在選擇性清除,dhfr基因可能受到藥物選擇壓力影響,為卵形瘧原蟲的藥物抗性監(jiān)測提供科學依據(jù),也為進一步研究卵形瘧原蟲抗性研究奠定了基礎。
【學位授予單位】：江蘇省血吸蟲病防治研究所
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R382.31

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本文編號：2666620