【摘要】：研究背景:燒傷早期創(chuàng)面瘀滯區(qū)進(jìn)行性壞死會(huì)造成燒傷創(chuàng)面深度加深、范圍擴(kuò)大,將會(huì)影響創(chuàng)面愈合情況及預(yù)后。對(duì)于大面積燒傷患者,創(chuàng)面加深和擴(kuò)大加重了病情,增加了治療難度,延長(zhǎng)了住院時(shí)間。對(duì)于小面積燒傷患者來講,創(chuàng)面加深和擴(kuò)大可導(dǎo)致增生性瘢痕的形成,影響功能和美觀。因此,對(duì)燒傷創(chuàng)面瘀滯區(qū)進(jìn)行性壞死的防治具有重要意義。低能量光療(Low level laser(light)therapy,LLLT)又稱光生物調(diào)節(jié)治療,即利用低能量的紅光及紅外光源(波長(zhǎng)范圍在600~1000nm)照射人體組織,進(jìn)而產(chǎn)生的一系列光生物刺激效應(yīng)。大量研究表明LLLT在治療急慢性創(chuàng)面上取得了明顯療效同時(shí)未觀察到不良反應(yīng)的發(fā)生。LLLT可抑制創(chuàng)面局部炎癥反應(yīng)、減輕水腫和疼痛,刺激成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及成骨細(xì)胞增殖與遷移,促進(jìn)膠原蛋白的合成,促進(jìn)毛細(xì)血管新生,促進(jìn)生長(zhǎng)因子的合成與釋放,進(jìn)而可以促進(jìn)創(chuàng)面愈合。但目前LLLT對(duì)燒傷創(chuàng)面瘀滯區(qū)進(jìn)行性壞死的治療作用未見明確報(bào)道。因此,本研究構(gòu)建大鼠燒傷瘀滯區(qū)模型,并探索早期局部LLLT對(duì)瘀滯區(qū)進(jìn)行性壞死的防治作用及其作用機(jī)制。第一部分:構(gòu)建大鼠燒傷創(chuàng)面瘀滯區(qū)模型并驗(yàn)證研究目的:大鼠燒傷瘀滯區(qū)模型的構(gòu)建及驗(yàn)證研究方法:40只SD雄性大鼠隨機(jī)分為4組,分別為正常對(duì)照組(Control Group CG,n=10)、造模后1h組(Model Group 1h,MG 1h,n=10),造模后24h組(Model Group 24h,MG 24h,,n=10),燒傷后96h組(Model Group 96h,MG 96h,n=10)。各組大鼠造模時(shí)采用腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉,背部脫毛。參照Regas FC和Ehrlich HP發(fā)明的銅梳燒傷模型~([1])。造模時(shí)采用梳齒狀銅塊,梳齒大小1cm*2cm,齒間距為0.5cm,共計(jì)4個(gè)梳齒3個(gè)間隙。實(shí)驗(yàn)時(shí),將梳齒狀銅塊放在98℃-100℃水中煮15min,使銅塊內(nèi)熱量均勻分布,利用銅塊自重壓迫于大鼠背部脊柱兩側(cè),放置10秒。梳齒直接接觸大鼠皮膚表面所致創(chuàng)面可視為壞死區(qū),8處壞死區(qū)之間的6個(gè)間隙可視為燒傷瘀滯區(qū)。對(duì)于CG大鼠,則將銅塊置于23℃-25℃水中15min,再利用銅塊自重壓迫于大鼠背部皮膚10秒。在造模后1、24、96h通過大體觀察和圖像處理軟件計(jì)算瘀滯區(qū)壞死比例,通過HMGB1免疫組化染色計(jì)算瘀滯區(qū)組織細(xì)胞壞死密度,利用HE染色、Massion染色和高頻超聲評(píng)估瘀滯區(qū)創(chuàng)面燒傷深度,最后通過皮膚多普勒血流超聲測(cè)量瘀滯區(qū)的血流變化。研究結(jié)果:大體觀察顯示在燒傷后96h內(nèi),燒傷創(chuàng)面瘀滯區(qū)和壞死區(qū)之間的邊界逐漸模糊、瘀滯區(qū)內(nèi)壞死組織逐漸增多、相鄰的壞死區(qū)有融合趨勢(shì)。燒傷后96h內(nèi)瘀滯區(qū)壞死組織比例不斷增加(P0.05),CG組、MG 1h組、MG 24h組、MG 96h組壞死比例分別為0%、2%、30%、64%。HMGB1免疫組化結(jié)果顯示燒傷后96h內(nèi)瘀滯區(qū)細(xì)胞壞死密度逐漸增加(P0.05),CG組、MG 1h組、MG 24h組、MG 96h組瘀滯區(qū)細(xì)胞壞死密度分別為1.2±0.3個(gè)/視野、14.2±2.0個(gè)/視野、58.0±8.5個(gè)/視野、81.3±13.9個(gè)/視野。HE染色及Massion染色顯示燒傷后瘀滯區(qū)的表皮層逐漸壞死、真皮水腫不斷加重、膠原壞死逐步變性、視野內(nèi)可見炎癥細(xì)胞逐漸聚集、微血管內(nèi)逐漸可見大量紅細(xì)胞淤積、瘀滯區(qū)和壞死區(qū)邊界逐漸模糊。高頻超聲結(jié)果顯示燒傷后96h內(nèi)瘀滯區(qū)表皮厚度無顯著變化(P0.05),表皮密度隨著時(shí)間不斷增加(P0.05),全層皮膚厚度隨著時(shí)間不斷增加(P0.05)。燒傷后24h內(nèi),其全層皮膚密度逐漸減少(P0.05),燒傷后96h的全層皮膚密度和前一時(shí)間點(diǎn)相比,無顯著差異(P0.05),但仍低于CG(P0.05)。皮膚多普勒血流超聲顯示燒傷后瘀滯區(qū)血流值隨著時(shí)間不斷減少(P0.05)。CG組、MG 1h組、MG 24h組、MG 96h組瘀滯區(qū)皮膚血流值分別為13.6±1.0 ml LD/min/100g、12.1±0.6 ml LD/min/100g、9.3±0.5 ml LD/min/100g、3.7±0.5 ml LD/min/100g。研究結(jié)論:1.成功通過梳齒狀銅塊法構(gòu)建大鼠燒傷創(chuàng)面瘀滯區(qū)模型2.本研究構(gòu)建的大鼠燒傷創(chuàng)面瘀滯區(qū),其壞死面積、燒傷深度以及細(xì)胞壞死密度在96h內(nèi)不斷增大,而瘀滯區(qū)創(chuàng)面的血流量在96h內(nèi)不斷減少。第二部分:早期局部LLLT對(duì)燒傷創(chuàng)面瘀滯區(qū)進(jìn)行性壞死的防治作用研究目的:探索早期局部LLLT對(duì)燒傷創(chuàng)面瘀滯區(qū)進(jìn)行性壞死的防治作用研究方法:將30只SD大鼠隨機(jī)分為2個(gè)組,分別為光療組(Laser Group,LG)和燒傷對(duì)照組(Control Group,CG),每組15只。采用第一部分方法于大鼠背部脊柱兩側(cè)制備燒傷創(chuàng)面瘀滯區(qū)模型,脊柱左側(cè)為照射創(chuàng)面(Laser wound,LW),直接接受LLLT,反應(yīng)LLLT對(duì)照射局部的作用,脊柱右側(cè)為遮蔽創(chuàng)面(shielded wound,SW),不直接接受LLLT,間接反應(yīng)LLLT對(duì)全身的影響。造模后立即給予LG的LW低能量光療,以后每24h照射1次,至燒傷后96h,共照射5次,每次30min。CG僅給予燒傷,不進(jìn)行光療;造模后1、24、96h分別使用高頻皮膚超聲及皮膚多普勒血流超聲評(píng)估瘀滯區(qū)結(jié)構(gòu)改變,并取瘀滯區(qū)組織做HE染色、HMGB1免疫組化、Caspase3免疫組化、血栓調(diào)節(jié)蛋白(thrombomodulin,TM)免疫組化,最后測(cè)量瘀滯區(qū)組織NO、TNF-α水平。研究結(jié)果:大體觀察結(jié)果顯示:燒傷96h后,LG組的LW瘀滯區(qū)壞死比例顯著少于其他所有瘀滯區(qū)創(chuàng)面(LG組的SW瘀滯區(qū)和CG雙側(cè)瘀滯區(qū),P0.05);HE染色結(jié)果顯示:燒傷96h后,相對(duì)于其他瘀滯區(qū)創(chuàng)面,LG的LW瘀滯區(qū)表皮壞死脫落較少、真皮水腫較輕、炎癥細(xì)胞聚集較少、微血管內(nèi)可見少量紅細(xì)胞淤積。高頻皮膚超聲結(jié)果顯示:燒傷96h后,LG的LW瘀滯區(qū)表皮密度、皮膚全層厚度小于其余瘀滯區(qū)(P0.05),皮膚全層密度高于其余瘀滯區(qū)(P0.05)。多普勒血流超聲檢測(cè)結(jié)果顯示:燒傷96h后,LG的LW瘀滯區(qū)血流量明顯大于其余瘀滯區(qū)(P0.05);HMGB1、Caspase3以及TM免疫組化結(jié)果顯示:燒傷96h后,LG的LW瘀滯區(qū)的HMGB1、Caspase3以及TM表達(dá)水平均低于其余各瘀滯區(qū)(P0.05);瘀滯區(qū)組織NO測(cè)量結(jié)果顯示:燒傷后24h和96h,LG的LW瘀滯區(qū)NO含量顯著高于其他瘀滯區(qū)(P0.05);瘀滯區(qū)組織TNF-α測(cè)量結(jié)果顯示:燒傷96h后,LG的LW瘀滯區(qū)TNF-α含量顯著低于其他瘀滯區(qū)(P0.05)。此外,本研究發(fā)現(xiàn):在燒傷后1、24、96h三個(gè)時(shí)間點(diǎn),LG的SW瘀滯區(qū)和CG雙側(cè)瘀滯區(qū)相比,其壞死組織比例,HE染色結(jié)果,高頻皮膚超聲結(jié)果,皮膚多普勒血流超聲檢測(cè)結(jié)果,HMGB1、Caspase3以及TM免疫組化結(jié)果以及TNF-α測(cè)量結(jié)果均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),僅在NO測(cè)量結(jié)果上有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,即在燒傷后96h,LG的SW瘀滯區(qū)NO含量顯著高于CG雙側(cè)瘀滯區(qū)(P0.05)。研究結(jié)論:1.早期局部LLLT能有效改善燒傷創(chuàng)面瘀滯區(qū)進(jìn)行性壞死,但其治療作用僅限于照射部位,無法通過LLLT的全身作用起效。2.早期局部LLLT對(duì)燒傷瘀滯區(qū)的防治作用可能與其改善瘀滯區(qū)血流量、減輕局部炎癥反應(yīng)、減少細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死有關(guān)。
【圖文】：

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （一）大體及組織學(xué)觀察　1.大體觀察大鼠脊柱兩側(cè)創(chuàng)面造模后即刻大體觀察表現(xiàn)為：由 8 個(gè)直接燙傷區(qū)及 6 個(gè)間隙構(gòu)成的梳齒狀燒傷創(chuàng)面，呈現(xiàn)壞死區(qū)和瘀滯區(qū)交替分布。壞死區(qū)呈現(xiàn)蒼白色水腫，邊界清晰，并有表皮損傷表現(xiàn)，瘀滯區(qū)無明顯改變。造模后 1h 瘀滯區(qū)出現(xiàn)少量灰黑色瘀斑和壞死組織，壞死面積 2%，見圖 1a。造模后 24h，，大鼠脊柱兩側(cè)創(chuàng)面瘀滯區(qū)瘀斑加重，并出現(xiàn)少量痂皮樣壞死組織，壞死面積 30%，見圖 1b。造模后 96h，兩側(cè)創(chuàng)面瘀滯區(qū)燙傷程度出現(xiàn)明顯加深現(xiàn)象，瘀滯區(qū)大部分出現(xiàn)壞死，壞死面積為64%，相鄰的凝固壞死區(qū)有融合趨勢(shì), 見圖 1c。造模后 1h，24h 以及 96h，瘀滯區(qū)壞死面積逐漸增大（P＜0.05），見圖 8a。CG 大鼠背部皮膚無特殊改變，壞死面積為 0%，見圖 1d。

圖 3a。造模后 24h，瘀滯區(qū)皮膚表皮部分壞死，瘀滯區(qū)真皮水腫加重，膠原變性壞死，視野內(nèi)可見炎癥細(xì)胞聚集，微血管內(nèi)可見紅細(xì)胞淤積, 可見少量壞死組織，見圖 2b，圖 3b。造模后 96h，表皮層大部分壞死，真皮水腫、組織結(jié)構(gòu)紊亂，膠原壞死變性，視野內(nèi)可見大量炎癥細(xì)胞聚集，微血管內(nèi)可見大量紅細(xì)胞淤積, 可見大量壞死組織，見圖 2c, 圖 3c。CG 大鼠背部皮膚組織 HE 及 Massion 染色圖類似正常皮膚組織，見圖 2d, 圖 3d。圖 2 造模后不同時(shí)間點(diǎn) HE 染色圖（50 倍）
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R644;R-332

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本文編號(hào)：2663952