【摘要】：腎細胞癌(renal cell cancer,RCC),簡稱腎癌,是起源于腎實質(zhì)小管上皮細胞的惡性占位性疾病,其中80～85%為透明細胞癌(clear cell RCC,ccRCC)。目前,對RCC發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的分子機制仍未完全認識,亟需進一步的研究。本課題組前期采用全基因組測序的方法檢測了 ccRCC組織和配對的癌旁腎臟組織的基因序列,并比較了兩組間的差異基因,從而發(fā)現(xiàn)大多數(shù)ccRCC組織中線粒體亮氨酰-tRNA 合成酶(mitochondrial leucyl-tRNA synthetase,LARS2)基因缺失或發(fā)生了突變,導(dǎo)致其功能喪失。這提示LARS2可能在ccRCC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。目的:研究LARS2在ccRCC中的表達水平,LARS2對ccRCC生物學(xué)行為的影響及其發(fā)揮作用的機制。材料和方法:(I)采用qRT-PCR、Western blot和ICC的方法檢測了 ccRCC細胞株和腎小管上皮細胞株中LARS2基因的RNA和蛋白質(zhì)表達水平;還采用qRT-PCR、Western blot和IHC的方法檢測了 ccRCC組織和對應(yīng)的癌旁腎臟組織中LARS2基因的RNA和蛋白質(zhì)表達水平。此外,研究了 ccRCC組織中LARS2的表達水平與患者臨床病理特征的關(guān)系,并分析了 LARS2對ccRCC患者預(yù)后的影響。(2)在ccRCC細胞株OS-RC-2、Caki-1和腎小管上皮細胞株HKC中建立了 LARS2過表達的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞和對照細胞;在HKC細胞株中建立了 LARS2低表達的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞和對照細胞。隨后檢測了它們的增殖情況、形成克隆的能力、周期、凋亡水平、ATP含量、活性氧水平,以及OS-RC-2細胞在免疫缺陷小鼠腎臟上長出腫瘤的能力,并將穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞與對照細胞的檢測結(jié)果相比較。(3)用 Western blot 法檢測了 LARS2 過表達的 OS-RC-2、Caki-1、HKC 細胞,LARS2低表達的HKC細胞和對照細胞中Ras/Raf/MEK/ERK、AMPKα、HIF-1α/mTOR和VHL/HIF-2α通路的激活水平,并將穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞與對照細胞的檢測結(jié)果相比較。結(jié)果:(1)與腎小管上皮細胞相比,ccRCC細胞中LARS2mRNA和蛋白質(zhì)的表達水平降低;與癌旁腎臟組織相比,ccRCC組織中LARS2mRNA和蛋白質(zhì)的表達水平顯著降低(P0.05)。LARS2mRNA的表達水平與ccRCC患者的臨床病理特征相關(guān),并且能影響ccRCC患者的預(yù)后,LARS2低表達的患者預(yù)后更差(P0.05)。(2)與對照細胞相比,LARS2過表達細胞增殖減慢,形成克隆能力減弱,細胞周期存在G1/S期阻滯,凋亡增加,ATP含量增多,活性氧水平降低,形成腎臟腫瘤的能力減弱(均P0.05)。與對照細胞相比,LARS2低表達細胞增殖加快,形成克隆能力增強,ATP含量減少,活性氧水平升高(均P0.05)。(3)與對照細胞相比,LARS2過表達細胞中Ras/Raf/MEK/ERK通路、AMPKα通路和mTOR通路的活性被抑制(均P0.05),VHL/HIF-2α通路的活性無明顯變化(P0.05)。與對照細胞相比,LARS2低表達細胞中Ras/Raf/MEK/ERK通路、AMPKα通路、mTOR通路被激活(均P0.05),VHL/HIF-2α通路的活性無明顯變化(P0.05)。結(jié)論:本研究發(fā)現(xiàn)了 LARS2在ccRCC組織和細胞中的表達水平顯著降低,LARS2的表達水平與ccRCC患者的臨床病理特征相關(guān)并且是影響ccRCC預(yù)后的危險因素。LARS2在ccRCC中發(fā)揮抑癌性作用,敲低LARS2會導(dǎo)致ccRCC細胞的惡性程度增強。LARS2功能缺失在ccRCC中發(fā)揮的作用與Ras/Raf/MEK/ERK、AMPKα通路、mTOR通路被激活有關(guān),而與VHL/HIF-2α通路無明顯的關(guān)聯(lián)。
【圖文】：

，相色譜儀測定ＴＨ－３０２藥物的含量。逡逑①微球包封率及載藥量計算的公式如下所示：逡逑載藥量＝（含藥量＋微球總重）Ｘ邋１００％逡逑包封率＝（實際載藥量＋理論載藥量）Ｘ邋１００％逡逑②線性與范圍的建立：逡逑精密稱�。玻担恚纾裕龋常埃苍�，溶于５ｍｌ體積比為１：９的甲醇和二氯甲烷的混合劑，，超聲使其完全溶解，母液配置完成。母液含量測定測定波長的選擇：空白輔料主藥ＴＨ－３０２進行紫外全波長掃描，確定ＴＨ－３０２最大吸收波長為３１６ｎｍ。移液管精移取母液邋０．１ｍｌ、０．２ｍｌ、０．４ｍｌ、０．６ｍｌ、０．８ｍｌ、１．２ｍｌ邋并定容至邋１０ｍｌ，配制濃度為邋５ｕｇ／ｍｌ１０ｕｇ／ｍｌ、２０ｕｇ／ｍｌ、３０ｕｇ／ｍｌ、４０ｕｇ／ｍｌ、５０ｕｇ／ｍｌ邋的一系歹ｉｊ樣品溶液，ＨＰＬＣ邋法進行外吸光度測定，測定波長為３１６ｎｍ，并以ＴＨ－３０２濃度（Ｘ）為橫坐標(biāo)，吸光值（Ｙ）縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)曲測定結(jié)果如圖１－１所示：逡逑１．２逡逑

進樣量：１０邋ｕ邋１。逡逑按上述色譜條件進行分析，以峰面積（Ｙ）為縱坐標(biāo)，ＴＨ－３０２藥物濃度（Ｘ）為橫坐逡逑標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖１－２所示：逡逑１２０．００邋．逡逑１００．００逡逑８０．００邋；逡逑＜６０．００邋：邋＾逡逑４０．００邐Ｉ—邋邐－邐逡逑２０．００邐：逡逑Ｑ邋Ｑ０邐邐邋邐逡逑０．００邐２．００邐４．００邐６．００邐８．００邐１０．００邐１２．００逡逑濃度（ｕｇ／ｍｌ）逡逑圖１－２邋ＴＨ－３０２藥物濃度與微球釋放度的關(guān)系逡逑１３逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.11

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本文編號：2663970