【摘要】：腎臟中腎小管和集合管對水的重吸收決定著機體的水平衡,而腎小管的小管液中溶質所形成的滲透壓,是對抗水重吸收的力量。因此,腎臟對水和電解質的重吸收和排泄是相互影響的過程,它們的平衡決定著腎臟功能的正常發(fā)揮。由于近端小管對水的重吸收是定比重吸收,而遠曲小管和集合管對水的重吸收是可調(diào)節(jié)的,該部位對水和電解質的重吸收和排泄對機體的水平衡發(fā)揮著決定性作用,因此其調(diào)節(jié)機制具有重要的意義。肌動蛋白細胞骨架可以調(diào)控細胞形狀、細胞運動等細胞過程。有文獻表明,肌動蛋白及其相關蛋白參與腎臟的水鹽代謝等各種功能的調(diào)節(jié)。在對血管加壓素處理的小鼠皮質集合管頂端膜進行的蛋白質組學分析中,人們發(fā)現(xiàn)約100種蛋白發(fā)生顯著變化,其中20%與肌動蛋白細胞骨架結構有關,這突出了肌動蛋白細胞骨架在調(diào)節(jié)水平衡中的重要作用。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),肌動蛋白微絲(actin filament,F-actin)的一個蓋帽蛋白--原肌球調(diào)節(jié)蛋白1(Tropomodulin1,Tmod1)在腎臟遠曲小管和集合管中特異表達,但其作用還有待研究。目的:通過研究Tmod1腎臟特異性敲除對小鼠腎臟水重吸收功能的影響,分析腎臟中與Tmod1相關的蛋白調(diào)控網(wǎng)絡,研究Tmod1對水通道蛋白及離子通道的影響,探討Tmod1對機體水平衡的調(diào)節(jié)及其作用機制。方法:1.利用免疫組化,確定Tmod1在小鼠腎臟中的表達和定位。2.構建Tmod1 ~(flox/flox)小鼠,并將其與腎小管和集合管特異表達Cre基因的Ksp-Cre小鼠雜交,獲得Tmod1腎臟特異性敲除小鼠Tmod1 ~(flox/flox)/Ksp-Cre~+(簡稱為TFK),用Tmod1 ~(flox/flox)/Ksp-Cre~-(簡稱為TF)小鼠作為對照。利用PCR和蛋白免疫印跡對小鼠進行鑒定。3.利用代謝籠測量并比較TF和TFK小鼠在基礎狀態(tài)、禁水和水負荷條件下的尿量、尿滲透壓;利用無創(chuàng)血壓測定儀測量兩種小鼠的血壓;利用生化分析,檢測尿液中的離子濃度,計算電解質的排泄量。4.利用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測TF和TFK小鼠血液中血管升壓素(AVP)的含量;向兩種小鼠腹腔注射AVP,收集并測量2小時后的尿量和尿滲透壓。5.分離TF和TFK小鼠的腎臟組織并提取蛋白,將其進行質譜蛋白質組學分析。對差異蛋白進行生物信息學分析,并對部分蛋白的表達進行驗證。6.利用實時定量PCR和免疫印跡,檢測TF和TFK小鼠腎臟中水通道和離子通道表達。結果:1.免疫組化結果顯示,Tmod1在腎臟遠曲小管和集合管表達。2.PCR和蛋白免疫印跡結果顯示,TFK小鼠的腎小管和集合管中Tmod1被敲除。3.代謝籠結果顯示,在基礎狀態(tài)下,TFK小鼠24小時尿量為0.81±0.14mL,顯著低于TF小鼠(1.59±0.12 mL,P0.01);其尿液滲透壓為5494±259 mOsm/kg,顯著高于TF小鼠的尿滲透壓(3843±106mOsm/kg,P0.01)。在禁水條件下,TFK小鼠的尿量為0.40±0.10 ml,亦明顯低于TF小鼠(0.93±0.18mL,P0.05);TFK小鼠的尿滲透壓為6512±977 mOsm/kg,顯著高于TF小鼠的尿滲透壓(3709±319mOsm/kg,P0.05)。在水負荷24小時的條件下,TFK小鼠尿量為8.50±0.85 mL,顯著低于TF小鼠(10.92±0.45 mL,P0.05),其尿滲透壓為878±145 mOsm/kg,顯著高于TF小鼠(492±16 mOsm/kg,P0.05)。血壓測量結果提示,TFK小鼠的收縮壓為97.9±0.8 mmHg,顯著高于TF小鼠(105.0±1.6 mmHg,P0.05)。4.TFK小鼠在基礎狀態(tài)下24小時內(nèi),主要電解質(包括Na~+、K~+、Cl~-、Ca~(2+)、P)和尿素的排泄量均較TF小鼠降低(P0.05)。5.ELISA檢測顯示,TFK小鼠血液中血管加壓素水平與TF小鼠無差異;兩種小鼠在注射AVP后,尿量均減少,尿滲透壓均升高。6.質譜分析結果顯示,與TF小鼠腎臟相比,在TFK小鼠腎臟中有83個差異表達(變化倍數(shù)2或0.5,P0.05)蛋白,其中13個上調(diào),70個下調(diào)。Gene Ontology分析顯示,差異表達基因與蛋白磷酸化、代謝過程、磷酸化過程和細胞內(nèi)信號轉導等生物過程有關,還與細胞外泌體、線粒體、溶酶體等細胞成分有關。7.蛋白免疫印跡實驗顯示,所篩選出的TGFβR2、SlC25A11和MTFP1等蛋白均在TFK小鼠腎臟中表達下調(diào)。8.qPCR和蛋白免疫印跡結果顯示,與TF小鼠腎臟相比,TFK小鼠腎臟中AQP2、AQP4和氯離子通道CFTR的表達均顯著上調(diào)。結論:Tmod1的敲除能夠引起小鼠尿濃縮能力的改變,使小鼠表現(xiàn)出少尿、高滲尿和高血壓的特征,腎臟中Tmod1可以影響多種蛋白的表達,參與調(diào)節(jié)腎臟的多種生物過程,特別是通過對水通道及離子通道的調(diào)節(jié),進而影響機體的水平衡穩(wěn)態(tài)。
【學位授予單位】：承德醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R334.1

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7 伍偉t，

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