【摘要】：目的:比較4種不同濃度水凝膠在鼠腦、肝、腎組織中的應(yīng)用,探索各種組織透明化過程中水凝膠濃度的最優(yōu)比,其次為優(yōu)化改良CLARITY肝臟組織水凝膠固定透明化技術(shù),基于該技術(shù)對(duì)肝癌模型鼠三維結(jié)構(gòu)的應(yīng)用研究。方法:1、按照原始水凝膠中丙烯酰胺(A)、甲叉雙丙烯酰胺(B)、多聚甲醛(P)的終濃度比,制備A4B4P4(A:B:P=4%:0.05%:4%)、A2B2P4(A:B:P=2%:0.025%:4%)、A1B1P4(A:B:P=1%:0.0125%:4%)、A4B4P0(A:B:P=4%:0.05%:0)水凝膠。選取8只昆明小鼠隨機(jī)分為4組,每組2只,分別采用A4B4P4、A4B4P0、A2B2P4、A1B1P4水凝膠進(jìn)行灌注,然后行組織固定及透明化處理。計(jì)算經(jīng)4種水凝膠處理后小鼠腦、肝、腎組織的相對(duì)透明度及蛋白損失量,同時(shí)對(duì)腦、肝、腎組織進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記,完成三維重建。2、利用雙相水凝膠進(jìn)行肝組織固定,將固定好的組織切成1mm厚的切片,隨機(jī)分為兩組,SDS組和SDS+脂肪酶組,SDS組采用十二烷基硫酸鈉SDS清除液進(jìn)行被動(dòng)脂質(zhì)清除9天,SDS+脂肪酶組先采用SDS清除液被動(dòng)脂質(zhì)清除5天,隨后浸泡于脂肪酶溶液中4天,兩組均進(jìn)行透明灰度值測(cè)定,并給予細(xì)胞核DAPI染色檢測(cè)標(biāo)記深度。3、選取25只SD大鼠,隨機(jī)分為對(duì)照組和造模組,造模組進(jìn)行18周腹腔注射二乙基亞硝胺DEN,對(duì)照組進(jìn)行18周腹腔注射生理鹽水。分別將對(duì)照組和造模組肝臟組織進(jìn)行蘇木素-伊紅染色,同時(shí)分別對(duì)兩組肝臟組織進(jìn)行透明化,同時(shí)然后進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記,完成三維重建,并測(cè)量管腔平均面積。結(jié)果:1、A2B2P4組、A1B1P4組小鼠腦組織相對(duì)透明度均高于A4B4P4、A4B4P0組(均P0.05);A1B1P4組小鼠肝組織的相對(duì)透明度高于其他3組(均P0.05);A2B2P4、A1B1P4組小鼠腎組織的相對(duì)透明度均高于A4B4P4、A4B4P0組(均P0.05)。A4B4P0組小鼠腦、肝、腎組織蛋白損失量均大于其他3組(均P0.05);A2B2P4組小鼠肝、腎組織蛋白損失量均低于A1B1P4組(均P0.05)。2、被動(dòng)脂質(zhì)清除過程中,第1天至第5天肝組織薄片的透明灰度值逐漸提升,但之后肝組織片清除速度緩慢,在第10天的清除仍然是不透明的;在第7、第9天,兩組相對(duì)透明灰度值比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);SDS+脂肪酶組DAPI染色深度達(dá)115um,而SDS組DAPI染色深度達(dá)60um,SDS+脂肪酶組DAPI滲透深度是SDS組的1.92倍。3、成功建造大鼠肝癌模型,病理診斷為肝癌組織結(jié)構(gòu),利用組織透明化技術(shù),完成對(duì)照組和造模組免疫熒光標(biāo)記,對(duì)照組小葉間動(dòng)、靜脈平均面積均低于肝癌組平均面積(P0.001)。結(jié)論:通過比較4種不同濃度水凝膠在鼠腦、肝、腎組織中的應(yīng)用,發(fā)現(xiàn)A2B2P4、A1B1P4水凝膠在腦組織透明化中的應(yīng)用效果較佳,A1B1P4、A2B2P4水凝膠分別在肝組織、腎組織透明化中的應(yīng)用效果最佳。通過優(yōu)化CLARITY技術(shù),發(fā)現(xiàn)雙相水凝膠組織固定聯(lián)合脂肪酶浸泡脂質(zhì)被動(dòng)清除技術(shù)可以快速實(shí)現(xiàn)鼠肝組織透明化�；诟伟┠Ｐ褪�,利用改良CLARITY技術(shù)對(duì)肝癌組織進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)重建,實(shí)現(xiàn)了研究組織三維結(jié)構(gòu)中空間位置關(guān)系分布,為CLARITY技術(shù)在肝臟組織病理學(xué)研究作出推動(dòng)作用。
【圖文】：

圖 1-1 4 種不同濃度配比水凝膠透明鼠腦（a）、肝（b）、腎（c）組織效果圖Fig.1-1 Four different concentrations of hydrogel transparent mouse brain (a), liver (b), kidney (c) tissue3.2 4 種濃度的水凝膠處理小鼠腦、肝、腎組織的相對(duì)透明度為了對(duì)透明度進(jìn)行量化，我們利用凝膠成像儀測(cè)定透明組織灰度值，同時(shí)引入相對(duì)透明度概念，即清除后與清除前的灰度值比值。通過改變水凝膠濃度配比，從而研究組織清除過程中對(duì)清除效率所產(chǎn)生的影響。我們發(fā)現(xiàn)（1）經(jīng)A4B4P4、A4B4P0處理后的腦組織的相對(duì)透明度均低于A2B2P4A1B1P4 組（均 P＜0.05）。（2）經(jīng) A4B4P4 處理后的肝組織的相對(duì)透明度均低于 A4B4P0、A1B1P4 組（均 P＜0.05），經(jīng) A4B4P0 處理后的肝組織的相對(duì)透明度僅低于 A1B1P4 組（均 P＜0.05）；經(jīng) A2B2P4 處理后的肝組織的相對(duì)透明度均低于 A4B4P0、A1B1P4 組（均 P＜0.05）。（3）經(jīng) A4B4P4、

RITY 技術(shù)及其在肝臟組織結(jié)構(gòu)學(xué)的應(yīng)用研究 碩士表 1-1 不同濃度水凝膠處理后腦 、肝、腎組織的相對(duì)透明度比較（x±s）-1 Comparison of relative transparency of brain, liver and kidney tissues after hydrogel with different concentrations (x±s)膠 N 腦組織 肝組織 腎組織4P4 4 8.03±0.16 3.27±0.16 5.60±0.184P0 4 8.25±0.15 4.35±0.24*4.36±0.252P4 4 8.69±0.13*#3.61±0.18#6.68±0.20*#1P4 4 8.93±0.21*#5.15±0.20*#ε6.91±0.18*#值 23 .927 57.432 59.044值 <0.001 <0.001 <0.001與 A4B4P4 比較，* P<0.05；與 A4B4P0 比較，#P<0.05；與 A2B2P4 比較，，εP<0.pared with A4B4P4 group, *p＜0.05. compared with A4B4P0 group, #p＜0.05. compareA4B4P0 group,εp＜0.05.
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R735.7;R-332

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本文編號(hào)：2663047