【摘要】：盲和視力受損是世界范圍內(nèi)嚴重的公共衛(wèi)生、社會和經(jīng)濟問題。在我國,由角膜病引發(fā)的角膜混濁是致盲的重要原因,僅次于白內(nèi)障。此前,本實驗室通過乙烷基亞硝基脲(ENU)誘導(dǎo)小鼠突變的方法獲得一例在C57BL/6(B6)背景下,突變雜合子表現(xiàn)為角膜混濁表型小鼠,突變基因鑒定發(fā)現(xiàn)該角膜病是由Mycn基因編碼區(qū)第1217位堿基(bp)處發(fā)生單個堿基轉(zhuǎn)換(T轉(zhuǎn)換為C),導(dǎo)致MYCN蛋白第406位氨基酸由V(纈氨酸)轉(zhuǎn)變?yōu)锳(丙氨酸)引起,故將該突變小鼠命名為Mycn V406A,另外遺傳實驗發(fā)現(xiàn)該小鼠突變純合子致死。故本文以MycnV406A突變雜合子(Mycn V406A/+)小鼠為研究對象,從以下三個部分開展研究:1、Mycn V406A角膜混濁小鼠遺傳實驗及角膜組織學(xué)分析將Mycn V406A/+小鼠與野生型B6小鼠配種,觀察后代小鼠表型并進行基因型鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在66只后代小鼠中有31只MyctnV406A/+基因型小鼠,其中20只表現(xiàn)為角膜混濁,4只具有明顯小眼表型,7只正常表型。在20只確定為角膜混濁的小鼠中,9只小鼠初生時(P0)出現(xiàn)眼瞼開放表型。故將Mycn V406A/+角膜混濁小鼠分為出生后眼瞼開放型和閉合型兩種類型。對6-8周(W)小鼠眼球H.E染色發(fā)現(xiàn):(1)相比于野生型小鼠,眼瞼開放型小鼠角膜上皮局部增厚,角膜基質(zhì)層常見新生血管及少量炎性細胞;(2)眼瞼閉合型小鼠角膜上皮略微變薄,角膜基質(zhì)層偶見新生血管。2、Mycn V406A突變對小鼠角膜上皮細胞分化的影響分析篩選出6-8 W出生后眼瞼開放型與閉合型角膜混濁小鼠,設(shè)同窩野生型小鼠對照。采用免疫組織化學(xué)技術(shù)對小鼠角膜上皮細胞keratin 12(Krt12)、keratin 14(Krt14)、keratin 10(Krt10)的表達情況進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)野生型小鼠角膜上皮所有細胞Krt12組化結(jié)果呈陽性、Krt10呈陰性,基底層少許細胞Krt14呈弱陽性;(2)眼瞼開放型小鼠角膜上皮細胞局部Krt12組化結(jié)果為陰性、除表層少許細胞外Krt14表達水平異常升高、局部異常表達Krt10;(3)眼瞼閉合型小鼠角膜上皮細胞Krt12及Krt10組化結(jié)果未見明顯異常,而Krt14表達與眼瞼開放型相似。正常小鼠于胚胎期16.5天(E16.5)眼瞼發(fā)生閉合,為了確定出生后眼瞼閉合型角膜混濁小鼠表型及角膜上皮細胞分化異常是否由胚胎期小鼠眼瞼閉合延遲直接引起,繼續(xù)對E16.5眼瞼開放比例進行統(tǒng)計并對MycnV406A/+E16.5小鼠眼區(qū)進行H.E和免疫組織化學(xué)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)遺傳統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)E16.5眼瞼開放小鼠比例類似于角膜混濁小鼠比例,且高于初生時眼瞼開放小鼠比例,提示部分小鼠眼瞼閉合延遲并于出生前閉合;(2)與野生型小鼠相比,MycnV406+E16.5眼瞼開放眼區(qū)角膜上皮異常增厚,Krt12表達異常且Krt14表達水平明顯升高,而MycnV406A/+E16.5眼瞼閉合眼區(qū)無異常,推測胚胎期眼瞼閉合延遲可能影響角膜上皮細胞分化。3、Mycn V406A突變影響角膜上皮細胞分化的機制的初步分析篩選出6-8 W出生后眼瞼開放型與閉合型角膜混濁小鼠,設(shè)同窩野生型小鼠對照。采用免疫組織化學(xué)技術(shù)對小鼠角膜上皮細胞周期蛋白D1(cyc1in D1)、整合素β 1(Integrin β1)、整合素β4(Integrin β4)、E-鈣粘素(E-cadherin)進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)野生型小鼠角膜上皮整合素β1、β4陽性細胞主要局限于基底層且整合素β1呈弱陽性;眼瞼開放型小鼠角膜上皮細胞整合素β1、β4均呈強陽性且角膜上皮增厚區(qū)呈陰性;眼瞼閉合型小鼠角膜上皮所有細胞整合素β1、β4呈強陽性。(2)與野生型小鼠相比,眼瞼開放型和閉合型小鼠角膜上皮細胞周期蛋白D1陽性細胞減少。(3)除開放型小鼠角膜表層細胞組化結(jié)果為陰性外,三組小鼠角膜上皮E-鈣粘素免疫組織化學(xué)均呈陽性且無明顯差異。研究顯示:在前期獲得一例角膜混濁小鼠并確定其由Mycn基因突變引起,在此基礎(chǔ)上進一步發(fā)現(xiàn)角膜混濁可分為出生后眼瞼開放型和閉合型兩種并對突變小鼠進行遺傳實驗、角膜上皮組織學(xué)分析,從而了解MycnV406A突變引起小鼠角膜病變特點;免疫組織化學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變小鼠角膜上皮細胞分化異常,該異�？赡芘c整合素β1、整合素β4、細胞周期蛋白D1表達異常有關(guān)。
【圖文】：

１．２．１邐ＭＡＸ／ＭＬＸ蛋白網(wǎng)絡(luò)逡逑ＭＹＣ蛋白家族及其相關(guān)的蛋白網(wǎng)絡(luò)在調(diào)節(jié)細胞生長、分化和營養(yǎng)代謝等多個過程中逡逑發(fā)揮著重要作用［ＩＣＭ４１邋（圖１）。ＭＹＣＮ蛋白是ＭＹＣ／ＭＡＸ蛋白網(wǎng)絡(luò)的一部分，，該蛋白網(wǎng)絡(luò)逡逑由幾個邋ｂＨＬＨＺｉｐ邋調(diào)控因子、ＭＹＣ邋家族（ｃ－ＭＹＣ，ＭＹＣＮ，邋ＭＹＣＬ）、ＭＸＤ邋家族（ＭＸＤ１，逡逑ＭＸＤ２，邋ＭＸＤ３，邋ＭＸＤ４）、ＭＡＸ網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)錄抑制因子（ＭＮＴ）和ＭＡＸ相關(guān)基因（ＭＧＡ）逡逑組成［１５＿１９］。ＭＹＣ和ＭＡＸ的異二聚體與Ｅ－ｂｏｘ序列ＣＡＣＧＴＧ結(jié)合［２（）’２１］，募集組蛋白乙酰逡逑轉(zhuǎn)移酶（ＨＡＴｓ）和Ｔａｔ作用蛋白６０ｋＤａ基因（ＴＩＰ６０）使染色質(zhì)保持開放結(jié)構(gòu)［２２＿２５］。所有逡逑ＭＹＣ家族同源基因和ｂＨＬＨＺｉｐ家族成員都與ＭＡＸ結(jié)合，每個復(fù)合物都有一組獨特的目逡逑的基因［２６，２７］。已知ＭＹＣ蛋白在結(jié)合前不活躍，所以ＭＹＣ／ＭＡＸ異二聚體對ＭＹＣ的功能逡逑至關(guān)重要［２８］。ＭＹＣ／ＭＡＸ異二聚體化通過募集ＨＡＴｓ促進增殖，而ＭＸＤ／ＭＡＸ依據(jù)ＨＤＡＣ逡逑活性抑制轉(zhuǎn)錄。有趣的是，ＭＸＤ的過表達可抑制ＭＹＣ的

使用蛛ｃ？－２５１引物對腳小鼠后代ＤＮＡ進行ＰＣＲ擴增，再經(jīng)Ｈｈａ邋Ｉ內(nèi)切酶酶逡逑切。由于小鼠一條ＤＮＡ鏈由于Ｔ轉(zhuǎn)變?yōu)椋�，邋ＧＴＧＣ轉(zhuǎn)變?yōu)椋牵茫牵枚磺虚_，逡逑野生型小鼠則不可切。以圖１．１中樣品為例可以看出ＰＣＲ產(chǎn)物大小約為２５１ｂｐ。逡逑Ｍｌ邋２３４５６７８逡逑５００ｂｐ逡逑ｌＯＯｈｐ邋Ｉ邐＾ｆｒ＇＇邐＇ｒ；逡逑圖１．１ＭＪ；Ｃ？＿Ｘ／＋小鼠酶切分型結(jié)果逡逑Ｆｉｇ．１．１邋Ｅｎｚｙｍｅ邋ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ａｆｙｃ？（撒■丨＂ｍｉｃｅ逡逑Ｍ：邋ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；邋１、２、３、５、６、８：野生型小鼠；４、７：邐小鼠逡逑Ｍ：邋ＤＬ２０００邋Ｍａｒｋｅｒ；邋Ｋ邋２＞邋３＞邋５＞邋６，邋８：邋Ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ邋ｍｉｃｅ；邋４＞邋７：邋ＭｙｃｒｔＶ４０６Ａ／＋ｍｉｃｅ逡逑２．２邐小鼠遺傳實驗結(jié)果逡逑將Ｂ６背景柳角膜混濁小鼠與野生型Ｂ６小鼠配種，并對后代小鼠進行觀察篩逡逑選。遺傳結(jié)果統(tǒng)計顯示：在６６只后代小鼠中，有３１只小鼠基因型為柳ｃ／／ｎ，其中２０逡逑只小鼠確定為角膜混濁（其中部分小鼠伴有小眼表型）（角膜混濁外顯率為６４．５邋％）邋，邋４逡逑只為嚴重小眼（由于眼球過小無法暴露，故不能確定是否同時伴有角膜混濁），７只為正逡逑常表型。在２０只確定為角膜混濁小鼠中，９只小鼠為初生時（Ｐ０）眼瞼開放小鼠并且該小逡逑鼠角膜混濁程度嚴重，故將角膜混濁小鼠分為出生后眼瞼開放型角膜混濁小鼠（圖１．２邋Ｃ）逡逑及出生后眼瞼閉合型角膜混濁小鼠（圖１．２邋Ｄ）（由于小鼠從Ｐ０－Ｐ１４具有一定死亡率
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R772.2;R-332

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本文編號：2662712