【摘要】：研究背景隨著終末期腎病患者數(shù)量不斷增加,腎移植供體短缺問題受到研究人員的廣泛關(guān)注。利用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)和囊胚互補(bǔ)技術(shù)在動物體內(nèi)再生人源化腎臟,有望成為人類腎臟移植供體來源的新途徑。通過該方法再造人源化腎臟的前提是要獲得腎臟缺失的動物模型。豬在解剖結(jié)構(gòu)、生理功能和器官大小上都與人有著高度的同源性且資源豐富,被認(rèn)為是可以為人iPSC發(fā)育分化提供微環(huán)境的理想動物。配對盒基因2(Paired box2,Pax2)是哺乳動物胚胎腎臟發(fā)育過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子,廣泛表達(dá)于前、中、后腎的發(fā)育過程中,并且與多種調(diào)節(jié)腎臟發(fā)育的因子相互作用,共同精確誘導(dǎo)生腎索形成、中腎管的形成和分化、輸尿管芽的生長和分支以及后腎間充質(zhì)的分化等。Pax2基因突變會導(dǎo)致小鼠腎臟缺失。然而,不同物種的腎臟發(fā)育過程以及相關(guān)信號分子的表達(dá)在時間和空間上都存在著差異,因此探究豬的腎臟發(fā)育過程以及腎臟發(fā)育過程中Pax2等信號分子的表達(dá)情況,制備Pax2基因敲除的豬細(xì)胞系,為后續(xù)構(gòu)建腎臟缺失或缺陷的豬模型奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),也為將來在豬體內(nèi)再生人源化腎臟提供了一定的理論依據(jù)。目的明確不同時期豬胎兒腎臟的發(fā)育情況,研究豬胎兒腎臟發(fā)育過程中相關(guān)信號分子的表達(dá)水平,利用CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated system)基因編輯技術(shù)制備Pax2基因敲除的豬胎兒成纖維細(xì)胞系。方法收集不同時期(胎齡為21.5天、27.5天、35天、45天、75天及110天)的豬胎兒腎臟組織,應(yīng)用蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin and eosin staining,HE染色)觀察不同時期豬胎兒腎臟的組織結(jié)構(gòu)。利用實(shí)時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)和蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot,WB)分別檢測豬腎臟發(fā)育相關(guān)信號分子(Pax2、Pax8、Six2、Six1、Sall1和Bmp4)的mRNA及蛋白表達(dá)水平,并進(jìn)一步利用免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)方法檢測Pax2在不同時期豬胎兒腎臟中的表達(dá)定位情況。采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),設(shè)計用于巴馬小型豬Pax2基因敲除的單導(dǎo)向RNA(single guide RNA,sgRNA)并構(gòu)建CRISPR/Cas9打靶載體,將打靶載體與pCMV-tdTomato質(zhì)粒(含G418抗性)共同轉(zhuǎn)染到原代豬胎兒成纖維細(xì)胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs)中,經(jīng)G418藥篩獲得單克隆細(xì)胞并進(jìn)行基因型鑒定,最終確定Pax2基因成功敲除的細(xì)胞系。結(jié)果27.5d時,豬胎兒的后腎已經(jīng)開始發(fā)育;35d時,早期腎小體已經(jīng)出現(xiàn),腎小管已經(jīng)開始發(fā)育;45d可觀察到近皮質(zhì)不成熟的腎小體和近髓質(zhì)成熟的腎小體;75d時,腎單位數(shù)目顯著增加,可以觀察到腎椎體、腎乳頭和腎盂;110d時,腎臟基本發(fā)育成熟,皮髓質(zhì)分界明顯,但仍有新的腎單位產(chǎn)生。qRT-PCR和WB結(jié)果顯示,75d的豬胎兒腎臟中Pax2、Pax8、Six2、Six1、Sall1和Bmp4基因的mRNA和蛋白表達(dá)量高于35d的表達(dá)量。通過免疫組化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析27.5d、35d、45d、75d和110d時期Pax2蛋白的表達(dá)定位情況,結(jié)果顯示,Pax2廣泛表達(dá)于輸尿管芽、后腎間充質(zhì)、帽狀間充質(zhì)、腎小囊體、逗號形體、S形體以及腎小管,并在后腎發(fā)育過程中持續(xù)表達(dá)。設(shè)計了巴馬小型豬Pax2基因的sgRNA并構(gòu)建了CRISPR/Cas9打靶載體,轉(zhuǎn)染原代豬胎兒成纖維細(xì)胞經(jīng)G418藥篩后獲得73個單克隆細(xì)胞,經(jīng)鑒定,40個克隆發(fā)生突變,突變效率為54.8%,其中Pax2雙等位基因敲除的細(xì)胞克隆有33個,可用于下一步體細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn),雙等位基因敲除效率為45.2%。因此,本實(shí)驗(yàn)成功制備了Pax2基因敲除的豬細(xì)胞系,為Pax2基因敲除豬模型的構(gòu)建奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【圖文】：

南京醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.不同時期豬胎兒腎臟的形態(tài)學(xué)分析為探究不同時期豬胎兒腎臟的發(fā)生發(fā)育情況，我們分別對胎齡21.5d、27.5d、35d、45d、75d 和 110d 的豬胎兒進(jìn)行解剖，收集腎臟樣本。在 21.5d 和 27.5d 的豬胎兒體內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)具有典型腎臟形態(tài)的腎臟器官。對 35d、45d、75d 及 110d 的豬胎兒進(jìn)行解剖，均獲得了具有典型腎臟形態(tài)的腎臟器官。所獲得的豬胎兒腎臟呈長而扁的蠶豆形，表面光滑。隨著豬胎兒發(fā)育時間的延長，其腎臟的體積逐漸增大、重量逐漸增加，測量結(jié)果顯示，35d 豬胎兒腎臟長約 4.0mm，重量約 0.0148g；45d 豬胎兒腎臟長約 8.5 mm，重量約 0.0627 g；75d 豬胎兒腎臟長約 24.5 mm，重量約 2.2267 g；110d 豬胎兒腎臟長約 36.6 mm，重量約 42.0067 g（圖 1）。

層的較成熟的腎小體；腎小囊體位于生腎區(qū)的淺表部分，而在生腎區(qū)較深部見 S 形體；在生腎區(qū)下方，小的血管球被豐富的間充質(zhì)細(xì)胞包繞，皮髓質(zhì)連的較大的血管球有明顯的毛細(xì)血管簇和更寬闊的腎小囊腔；腎小管數(shù)量增多構(gòu)進(jìn)一步完善（圖 4A、B、C、D）。75d，皮質(zhì)明顯變得更寬并且包含更多球，血管球毛細(xì)血管數(shù)量增多，，腎小囊腔增大；集合管形成，管腔較大；近單位發(fā)生較早，隨著集合小管末端不斷向皮質(zhì)淺層生長并分支，不斷誘導(dǎo)后充質(zhì)形成淺表腎單位；生腎區(qū)明顯變薄，可見少量的腎小囊體和較多的 S ；近端小管和遠(yuǎn)端小管結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜完善，數(shù)量顯著增加；可以觀察到腎椎體乳頭、腎大盞、腎小盞和腎盂（圖 5A、B、C、D）。110d，腎臟發(fā)育基本成熟構(gòu)基本完善；腎小體形態(tài)清晰完整，腎小管在腎小體周圍緊密排列，周圍間胞減少；皮質(zhì)髓質(zhì)分界清楚，可觀察到髓放線；生腎區(qū)有少量 S 形體，仍有腎單位形成（圖 6A、B、C、D）。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R-332;R699.2

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