【摘要】：弓形蟲是一種專性胞內(nèi)寄生的頂復(fù)門原蟲,幾乎能在所有恒溫動物(鳥和哺乳動物)的有核細(xì)胞內(nèi)建立感染,由其引起的弓形蟲病在世界范圍內(nèi)廣泛分布與流行。近年來,隨著免疫缺陷型患者的增多,弓形蟲病的發(fā)病率也呈不斷上升趨勢。弓形蟲入侵宿主細(xì)胞時在蟲體與宿主細(xì)胞膜接觸處形成移動聯(lián)接復(fù)合物(MJ)來幫助蟲體錨定于宿主細(xì)胞表面并幫助蟲體完成入侵過程。目前已知的MJ復(fù)合物成員棒狀體頸部蛋白(RON)2,4,5的功能已有相應(yīng)的研究報道,但其間蛋白的相互作用模式還尚不清楚。其中TgRON4作為入侵的關(guān)鍵分子,已有研究表明敲除該分子影響蟲株入侵率但并不致死。通過同源性比對,我們找到TgRON4的同源基因TgRON4L1,探究其在TgRON4缺失時是否對蟲體入侵起到一定的補(bǔ)償作用。本研究根據(jù)弓形蟲基因組數(shù)據(jù)庫ToxoDB中TgRON4L1的基因序列的分析結(jié)果,截短部分序列進(jìn)行擴(kuò)增,原核表達(dá)制備了 TgRON4L1的多克隆抗體,檢測到TgRON4L1在蟲體入侵時定位于移動聯(lián)接復(fù)合物上。體外真核細(xì)胞表達(dá)移動聯(lián)接復(fù)合物成員TgRON4和同系物TgRON4L1以及TgRON5,通過免疫共沉淀試驗發(fā)現(xiàn)TgRON4L1,TgRON4與TgRON5有直接相互作用。為進(jìn)一步探究TgRON4L1的功能,我們通過CRISPER/Cas9技術(shù)敲除弓形蟲速殖子階段的TgRON4L1基因,篩選獲得單克隆蟲株,發(fā)現(xiàn)缺失TgRON4L1不影響蟲體入侵及逸出宿主細(xì)胞和宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的能力,而在TgRON4缺失蟲株中,TgRON4L1的表達(dá)量卻明顯上調(diào)。以上結(jié)果說明弓形蟲棒狀體頸部蛋白TgRON4L1是弓形蟲移動聯(lián)接復(fù)合物上的成員,并且其在功能上與TgRON4有著一定的補(bǔ)償作用。
【圖文】：

根據(jù)下載的ＴｇＲＯＮ４Ｌｌ基因序列設(shè)計引物經(jīng)ＰＣＲ擴(kuò)增Ｎ端（邋１０００－１５０３邋ｂｐ）和Ｃ逡逑端（３００１－４００２邋ｂｐ）基因序列，，ＰＣＲ產(chǎn)物經(jīng)１％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，如圖所示擴(kuò)增逡逑出ＴｇＲＯＮ４Ｌｌ－Ｎ邋５００邋ｂｐ及ＴｇＲＯＮ４Ｌｌ－Ｃ１０００ｂｐ左右目的條帶（圖１）。逡逑

Ｍ邐Ｍ逡逑（■ｍｍ邋５０００邋ｂｐ逡逑Ｉ邋３０００邋ｂｐ逡逑Ｉ邋２０００邋ｂｐ逡逑１５００邋ｂｐ逡逑８００邋ｂｐ逡逑￡－邐Ｉ邋５００邋ｂｐ逡逑３００邋ｂｐ逡逑圖１邋ＴｇＲＯＮ４Ｌｌ－Ｎ／Ｃ截短基因的ＰＣＲ擴(kuò)增結(jié)果逡逑Ｆｉｇ．邋１邋Ａｇａｒｏｓｅ邋ｇｅｌ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ＴｇＲＯＮ４Ｌｌ－Ｎ／Ｃ邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ逡逑２邋ｐＧＥＸ４Ｔ－３－ＴｇＲＯＮ４Ｌｌ邋重組質(zhì)粒的鑒定逡逑的片段連接于內(nèi)切酶Ｘｈｏｌ和ＢａｍＨＩ處理的ｐＧＥＸ－４Ｔ－３載體，經(jīng)１％瓊脂定（圖２），回收載體片段。擴(kuò)增的ＴｇＲＯＮ４Ｌｌ－Ｎ／Ｃ截斷片段與回４Ｔ－３進(jìn)行同源重組后，菌落ＰＣＲ鑒定如圖均為陽性克隆（圖３）。逡逑Ｍ逡逑
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.7;R382.5

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 趙禹;孫曉林;朱興全;周東輝;;頂復(fù)門原蟲棒狀體頸部蛋白研究的新進(jìn)展[J];中國人獸共患病學(xué)報;2015年08期

2 徐穎;高琦;徐前明;朱興全;;弓形蟲棒狀體頸部蛋白及棒狀體蛋白研究的新進(jìn)展[J];中國人獸共患病學(xué)報;2013年12期

本文編號：2660182