【摘要】：促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin;Epo)是一種主要由成人腎臟和胎兒肝臟分泌的造血生長因子,屬于Ⅰ型細(xì)胞因子超家族成員,既往因其在刺激造血干細(xì)胞的增殖與分化中的關(guān)鍵作用而在臨床廣泛應(yīng)用于治療各種原因引發(fā)的貧血。促紅細(xì)胞生成素受體(Erythropoietin receptor;Epo R)是Epo的特異性受體,屬于單跨膜I型細(xì)胞因子受體,Epo通過與Epo R結(jié)合而激活下游的信號通路產(chǎn)生各種生物學(xué)作用。近些年來,關(guān)于Epo信號通路的非刺激造血的作用不斷被報道,特別是在各種類型的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中表現(xiàn)出的組織保護(hù)作用受到廣泛的關(guān)注。Epo與Epo R在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元及內(nèi)皮細(xì)胞中均有廣泛的表達(dá),實驗研究證明Epo在包括中風(fēng)、多發(fā)性硬化、自身免疫性腦髓炎、精神分裂癥、腦損傷及脊髓損傷(spinal cord injury;SCI)等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有明顯的神經(jīng)保護(hù)和促進(jìn)神經(jīng)再生的作用。SCI是一種臨床工作中常見的嚴(yán)重致殘性疾病,給家庭和社會帶來了巨大的痛苦和損失,目前尚且沒有有效的治療手段。SCI的病理過程主要由原始的物理損傷和繼發(fā)的化學(xué)損傷組成,由于原始損傷的不可預(yù)估性,目前的治療研究主要集中于控制各種急性缺血壞死及各種炎性反應(yīng)所帶來的繼發(fā)損傷。研究發(fā)現(xiàn)Epo可以明顯的促進(jìn)SCI后的神經(jīng)功能恢復(fù),其作用可能通過抗炎、抗凋亡及促進(jìn)血管再生等多種機制來完成,而且目前已經(jīng)有Epo在臨床實驗性應(yīng)用的初步報道,這使得Epo成為非常有臨床應(yīng)用潛力的治療SCI的藥物之一。Epo信號通路促進(jìn)腦損傷神經(jīng)功能恢復(fù)的一個重要機制是促進(jìn)腦內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells;NSCs)向神經(jīng)元分化,而這同樣也是解決應(yīng)用NSCs修復(fù)SCI的關(guān)鍵問題。成體脊髓屬于非神經(jīng)生發(fā)區(qū)“non-neurogenic area”,正常情況下沒有新生神經(jīng)元產(chǎn)生,即使在SCI后內(nèi)源性NSCs大量增殖,但因為脊髓內(nèi)環(huán)境的嚴(yán)重破壞,最終也基本上全部分化成為星型膠質(zhì)細(xì)胞最終形成疤痕實際阻礙了神經(jīng)再通。由于干細(xì)胞分化與其所處的微環(huán)境直接相關(guān),Epo信號通路的神經(jīng)保護(hù)作用為改善SCI后的內(nèi)環(huán)境提供了可能,這就給脊髓內(nèi)源性NSCs的神經(jīng)生發(fā)提供了機會,Epo促進(jìn)SCI后功能恢復(fù)已經(jīng)被廣泛證實,多種作用機制已經(jīng)被發(fā)現(xiàn),但其對脊髓內(nèi)源性NSCs增殖分化的作用及其能否作為其作用機制的一部分目前尚且沒有文獻(xiàn)報道。本課題設(shè)計通過三部分研究探討Epo信號通路對大鼠脊髓內(nèi)源性NSCs增殖分化的影響。實驗第一部分是Epo對SCI大鼠內(nèi)源性NSCs增殖分化影響的在體研究。取成年SPF級SD大鼠,改良Allen法制備大鼠SCI模型,實驗組腹腔注射Epo(5000U/kg)×7天,對照組腹腔注射等量生理鹽水×7天。術(shù)后分別于2天、8天及14天取材,對內(nèi)源性NSCs、神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞行免疫熒光染色,同時對Epo及Epo R的表達(dá)行Western blot檢測。結(jié)果顯示實驗組神經(jīng)元(P0.01)及少突膠質(zhì)細(xì)胞分化(P0.05)比例明顯增高,星型膠質(zhì)細(xì)胞(P0.05)分化比例明顯減少,內(nèi)源性NSCs數(shù)量兩組之間無顯著性差別。Epo注射增加了SCI后Epo和Epo R的表達(dá),但在2天和8天與對照組之間沒有顯著性差異,在14天實驗組則明顯強于對照組(P0.01),說明Epo腹腔注射能夠明顯的延長SCI后的Epo信號通路的作用時間,促進(jìn)神經(jīng)元及少突膠質(zhì)細(xì)胞分化,減少星型膠質(zhì)細(xì)胞的分化,但對于內(nèi)源性NSCs增殖沒有影響。實驗第二部分是Epo對正常大鼠內(nèi)源性NSCs增殖分化影響的在體研究。取成年SPF級SD大鼠,實驗組腹腔注射Epo(5000U/kg)×7天,對照組腹腔注射等量生理鹽水×7天,術(shù)后分別于2天、8天及14天取材,對內(nèi)源性NSCs、神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞行免疫熒光染色,同時對Epo及Epo R的表達(dá)行Western blot檢測。結(jié)果顯示Epo腹腔注射在2天和8天可以明顯提高Epo的表達(dá)(P0.01),但到14天Epo的表達(dá)與對照組已經(jīng)沒有差別。Epo R的表達(dá)在三個時間點均明顯高于對照組(P0.01)。對于內(nèi)源性NSCs的數(shù)量及分化沒有影響。實驗第三部分是Epo對大鼠內(nèi)源性NSCs增殖分化影響的體外研究。證實Epo信號通路對內(nèi)源性NSCs的直接作用結(jié)果。獲取SCI后脊髓內(nèi)源性NSCs行體外培養(yǎng),分Epo組(10U/ml)、空白組及Epo+抑制劑組,體外培養(yǎng)7天后,對內(nèi)源性NSCs進(jìn)行神經(jīng)球計數(shù)、測量平均直徑及流式細(xì)胞檢測,進(jìn)行神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞行免疫熒光染色,同時對Epo及Epo R的表達(dá)行Western blot檢測。結(jié)果提示Epo及Epo R的表達(dá)明顯增加,實驗組神經(jīng)元(P0.01)及少突膠質(zhì)細(xì)胞分化(P0.05)比例明顯增高,星型膠質(zhì)細(xì)胞(P0.05)分化比例明顯減少,抑制劑組可以消除Epo的作用效果,內(nèi)源性NSCs數(shù)量兩組之間無顯著性差別。綜上所述,SCI后及體外實驗均證明外源性Epo能夠延長或者增強Epo信號通路的作用,進(jìn)而促進(jìn)大鼠內(nèi)源性NSCs向神經(jīng)元及少突膠質(zhì)細(xì)胞分化,減少星形膠質(zhì)細(xì)胞分化,但對增殖沒有影響。對于正常大鼠,外源性Epo雖然可以激活信號通路,但對于內(nèi)源性NSCs的增殖分化均沒有影響。
【圖文】：

圖 1: Epo 信號通路促進(jìn) SCI 大鼠脊髓內(nèi)源性 NSCs 的神經(jīng)元分化。免疫熒光染色顯示在 SCI后 2 天、8 天及 14 天，SCI+Epo 組的神經(jīng)元分化均明顯優(yōu)于 SCI+Saline 組，數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示P<0.01。β-tubulin 呈綠色，BrdU 呈紅色，，DAPI 呈藍(lán)色。比例尺：25 μm。Figure 1. Epo signaling promote neuronal differentiation of endogenous NSC in spinal cord afterSCI. Fluorescence immunostaining images (merged) showing the co-localization of β-tubulin (green)with BrdU (red) at 2, 8, and 14 days in the Epo- and Saline-treated groups after SCI. DAPI (blue) wasused as a nuclear counterstain. Quantitative analysis showed an increased density of β-tubulin+/BrdU+cells at all three time points (P<0.01) in the SCI+Epo vs SCI+Saline groups. Scale bars: 25 μm.SCI+Epo 組的新生少突膠質(zhì)細(xì)胞分化在 2 天時與 SCI+Saline 組無明顯差別（12.8(10.2,13.0)% vs 11.7(10.6,12.4)%；p>0.05），但在第 8 天（14.6(13.9,17.6)% vs

圖 2：Epo 信號通路促進(jìn) SCI 大鼠脊髓內(nèi)源性 NSCs 的少突膠質(zhì)細(xì)胞分化。免疫熒光染色顯示在 SCI 后第 2 天兩組少突膠質(zhì)細(xì)胞分化無明顯差別(P>0.05)，但在 SCI 后的第 8 天及 14 天，SCI+Epo 組的少突膠質(zhì)細(xì)胞分化均明顯優(yōu)于 SCI+Saline 組(P<0.05)。O4 呈綠色，BrdU 呈紅色，DAPI 呈藍(lán)色。比例尺：25 μm。Figure 2. Epo signaling promote oligodendrocytic differentiaiton of endogenous NSC in spinalcord after SCI.Fluorescence immunostaining images (merged) showing the co-localization of O4(green) with BrdU (red) at 2,8 and 14 days in the Epo- and Saline-treated groups after SCI. DAPI(blue) was used as a nuclear counterstain. Quantitative analysis showed an increased density ofO4+/BrdU+cells at day 8 and day 14 time points (P<0.05) in the SCI+Epo vs SCI+Saline groups, andno difference between two groups at day 2(P>0.05).Scale bars: 25 μm.SCI+Epo 組的星型膠質(zhì)細(xì)胞分化比例上在三個時間點上均明顯少于 SCI+Saline
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R329.2

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本文編號：2658433