【摘要】：弓形蟲是細胞內寄生原蟲,呈世界性分布,廣泛寄生于人和動物的有核細胞內。能夠感染所有溫血動物,包括人,引起人畜共患弓形蟲病。血清學調查結果表明,全世界約有3 0%的人感染弓形蟲。免疫功能正常的宿主感染弓形蟲后,一般表現(xiàn)出沒有明顯癥狀的感染情況。現(xiàn)在的研究表明,弓形蟲的這種隱性感染模式雖然沒有明顯的癥狀,但是能夠侵入宿主的神經系統(tǒng),影響神經細胞的功能,從而導致宿主腦損害,甚至精神疾病的發(fā)生�，F(xiàn)在,越來越多的證據(jù)表明弓形蟲慢性感染能影響神經細胞損傷并參與神經系統(tǒng)疾病。新近研究發(fā)現(xiàn),Non-coding RNA(ncRNA)是基因組中一類重要的非編碼RNA,不具有蛋白編碼功能,但是在生命過程中卻發(fā)揮著重要的調控功能。其中長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)的長度大于200個核苦酸,作為神經系統(tǒng)一類重要的非編碼RNA,通過與靶基因mRNA結合,調控基因轉錄后表達,在許多神經相關性疾病中起著重要的調節(jié)作用。在本研究中,我們用PRU株弓形蟲包囊經口感染小鼠,建立弓形蟲慢性感染小鼠模型,通過微陣列芯片檢測lncRNA與mRNA在正常組與感染組的表達水平。通過熱圖、散點圖分析差異表達的lncRNA和mRNA,通過cis/trans預測靶基因對差異的lncRNA進行靶基因的預測并進行GO、KEGG富集分析,將相應的基因根據(jù)功能的不同歸類,將有差異的pathway進行富集,從而將相應的基因進行注釋及分類,找到實驗條件下顯著性差異變化的生物學調控通路并確定研究的lncRNA及相應靶基因。通過生物信息學方法對lncRNA進行定位分析并確定核質位置。通過實時定量PCR擴大樣本驗證lncRNA及靶基因的表達。免疫組化、免疫熒光檢測感染弓形蟲慢性感染腦組織中蛋白的變化。利用CCK-8、流式細胞術、克隆形成、TUNEL等實驗在細胞水平上研究lncRNA的功能。通過構建shRNA和過表達體系,研究lncRNA的表達變化對靶基因表達的影響,并通過Western blot檢測蛋白變化。此外,我們通過RNA Pull down實驗將與lncRNA相關的蛋白拉下來,并通過質譜分析,鑒定蛋白的種類,進一步揭示lncRNA調控下游靶基因的機制。芯片數(shù)據(jù)顯示,感染弓形蟲的小鼠腦組織中l(wèi)ncRNA和mRNA的表達發(fā)生了較大的變化,通過篩選發(fā)現(xiàn)lncRNA11496在弓形蟲慢性感染腦組織中的表達差異變化較大。通過GO、KEGG富集分析,對lncRNA的靶基因和mRNA進行基因注釋及分類,發(fā)現(xiàn)lncRNA11496和宿主精神行為的改變密切相關;通過cis/trans預測了 lncRNA11496的基因,確定lncRNA11496靶基因是Mef2c。我們證實lncRNA11496定位于細胞核內。同時,我們通過qPCR驗證發(fā)現(xiàn),lncRNA11496和Mef2c都是下調的。我們通過熒光定量PCR檢測了干擾及過表達lncRNA11496以后,檢測相應靶基因Mef2c的表達變化,結果顯示,lncRNA11496正向調控Mef2c的表達。同時,我們通過Western blot檢測了蛋白水平上的表達,進一步驗證了這一結果。在體外培養(yǎng)的神經細胞中,我們轉染shRNA干擾lncRNA11496及過表達lncRNA11496,通過CCK-8和克隆形成實驗發(fā)現(xiàn),干擾了 lncRNA11496以后,細胞增殖變得緩慢,而過表達lncRNA1 1496以后,發(fā)現(xiàn)細胞增殖變快。我們進一步通過流式細胞術檢測了細胞周期的變化,發(fā)現(xiàn)lncRNA的變化影響了細胞G1、G2和S期的占比,進而影響了細胞的增殖情況。此外,我們還發(fā)現(xiàn),干擾lncRNA1 1496的表達能夠促進細胞凋亡,而lncRNA11496表達增加能夠抑制細胞凋亡。通過RNA pull down及質譜分析,我們發(fā)現(xiàn)lncRNA1 1496是通過結合HDAC2來影響Mef2c的表達,進而調控神經細胞的增殖分化和凋亡。綜上所述,本研究通過微陣列芯片技術檢測了感染Ⅱ型弓形蟲后,小鼠腦內lncRNA和mRNA的差異表達。發(fā)現(xiàn)lncRNA11496差異表達顯著并與精神行為密切相關,并且證明lncRNA11496是通過結合HDAC2來調控其靶基因Mef2c的表達,進而影響小膠質細胞的增殖、周期及凋亡。進一步闡明了lncRNA在弓形蟲慢性感染小鼠腦中的作用和調控機制,對弓形蟲對宿主神經系統(tǒng)侵害的防治會開辟一個嶄新的方向。
【圖文】：

我們通過對差異表達的ＩｎｃＲＮＡ和ｍＲＮＡ進行熱圖分析，可以直觀顯示在逡逑慢性感染弓形蟲和正常小鼠腦組織中不同基因的表達水平。發(fā)現(xiàn)共有１５００個逡逑ＩｎｃＲＮＡ的表達發(fā)生差異，其中６６２個上調，８３８個下調（圖１Ａ），有８６４個ｍＲＮＡ逡逑發(fā)生變化，３５６個上調，５０８個下調（圖１Ｂ）。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑－１．５邐０邐１．５邐－１．５邐０邐１．５逡逑■邋■逡逑ＥＸ１邋ＥＸ２邋ＥＸ３邋ＣＴ１邋ＣＴ２邋ＣＴ３邐ＥＸ１邋ＥＸ２邋ＥＸ３邋ＣＴ１邋ＣＴ２邋ＣＴ３逡逑圖１．熱圖分析感染組和未感染組小鼠腦組織中ＩｎｃＲＮＡ和ｍＲＮＡ的差異表達逡逑Ａ．邋ＩｎｃＲＮＡ的表達水平；Ｂ．邋ｍＲＮＡ的表達水平。逡逑Ｆｉｇｌ．邋Ｈｅａｔ邋ｍａｐｓ邋ａｎａｌｙｚｅ邋ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｌｅｖｅｌｓ邋ｏｆ邋ＩｎｃＲＮＡ邋ａｎｄ邋ｍＲＮＡ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｂｒａｉｎ邋ｏｆ逡逑ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ａｎｄ邋ｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ｍｉｃｅ逡逑Ａ．邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｌｅｖｅｌ邋ｏｆ邋ＩｎｃＲＮＡ；邋Ｂ．邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｌｅｖｅｌ邋ｏｆ邋ｍＲＮＡ．逡逑１７逡逑

一個而威爾直角坐標系中。散點圖中Ｘ軸，Ｙ軸分別表示該點在對照及實驗樣品逡逑芯片中處理的信號值。通過散點圖，進一步分析了邋ＩｎｃＲＮＡ及ｍＲＮＡ在弓形蟲慢逡逑性感染小鼠腦組織中的差異變化（圖２Ａ，２Ｂ）。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑１５邐１５逡逑？邋／逡逑ｉｏ邐，？？邐？？，邐１0逡逑P牛簀義希靛危保板危保靛危靛危保板危保靛義賢跡玻⒌閫擠治霾煌虻謀澩鎪藉義希粒澹桑睿悖遙危戀謀澩鎪劍唬攏澹恚遙危戀謀澩鎪�。辶x希疲椋紓玻澹鈴澹螅悖幔簦簦澹蟈澹穡歟錚翦澹幔睿幔歟澹簀澹簦瑁邋澹澹穡潁澹螅螅椋錚鑠澹歟澹觶澹歟簀澹錚駑澹洌椋媯媯澹潁澹睿翦澹紓澹睿澹簀義希粒澹裕瑁邋澹澹穡潁澹螅螅椋錚鑠澹歟澹觶澹戾澹錚駑澹桑睿悖遙危粒誨澹攏澹裕瑁邋澹澹穡潁澹螅螅椋錚鑠澹歟澹觶澹戾澹錚駑澹恚遙危粒義希常危牽稀ⅲ耍牛牽歉患治霾鉅轂澩锏幕蟈義銜私徊椒治霾鉅轂澩锏模桑睿悖遙危漣謝蠔停恚遙危�，通过肯、ＫＥ壳富集辶x戲治霾鉅轂浠幕潁湊展δ艿牟煌泄槔啵鉅煜災模穡幔簦瑁鰨幔�？行刚d義霞�，对基因进袃储识d頭擲啵�，磦蝤諛I(yè)教囟ㄊ笛樘跫虜鉅轂浠模穡幔簦瑁鰨幔�。结辶x瞎允靜鉅轂澩锏模桑睿悖遙危漣謝虼蟛糠指患諫窬钚耘涮迨芴遄饔茫喟桶峰義賢淮�、箘癖酸突触、神经细胞的X鮒撤只暗蟯齙刃藕磐罰ㄍ跡常粒澹常攏�。辶x喜鉅轂澩锏模恚遙危鏈蟛糠指患詰�，趋化因讬熏｀嵟科信号通铝P評脲義獻有藕磐

本文編號：2658383