發(fā)布時間：2020-05-11 18:39

【摘要】：第一部分三七皂苷R1改善糖皮質(zhì)激素抑制哮喘小鼠氣道上皮損傷修復(fù)的作用研究目的:觀察三七皂苷R1是否對糖皮質(zhì)激素抑制哮喘小鼠氣道上皮的損傷修復(fù)具有治療作用。方法:利用屋塵螨(HDM,House dust mites)滴鼻建立小鼠哮喘模型,在最后3次激發(fā)之前半小時給予糖皮質(zhì)激素-地塞米松(Dex,Dexamethasone)腹腔注射小鼠,同時腹腔注射三七皂苷R1(PNS-R1,Panax notoginseng saponins R1)溶液。末次激發(fā)24小時內(nèi)利用有創(chuàng)肺功能氣管插管檢測小鼠肺功能,收取小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF,Bronchoalveolar lavage fluid)標(biāo)本,利用細胞計數(shù)儀計數(shù)肺泡灌洗液中細胞總數(shù),瑞氏染色后計數(shù)細胞分類情況及BALF中脫落的細胞數(shù)。收集小鼠氣管及左肺組織進行脫水石蠟包埋切片后,進行HE染色和免疫組化E-cadherin染色,觀察小鼠氣道上皮細胞損傷修復(fù)情況;利用TUNEL染色觀察小鼠氣道上皮細胞凋亡情況,免疫組化和Western blot技術(shù)檢測肺組織氣道上皮中凋亡蛋白Caspase3表達情況;PAS糖原染色觀察小鼠氣道粘液分泌情況。ELISA檢測肺泡灌洗液中上皮損傷相關(guān)因子IL-33和TSLP含量。結(jié)果:1.哮喘小鼠肺通氣阻力、氣道炎癥和氣道粘液分泌較對照組明顯增加,Dex和PNS-R1均可以明顯減輕哮喘小鼠肺通氣阻力、氣道炎癥以及氣道粘液高分泌,但Dex和PNS-R1共同治療組的小鼠肺通氣阻力、氣道炎癥以及氣道粘液分泌與單純使用Dex治療的小鼠無差異。2.Dex治療哮喘小鼠會明顯增加BALF中脫落的上皮細胞數(shù)和損傷相關(guān)因子IL-33和TSLP含量,降低氣道上皮細胞完整性;在Dex的基礎(chǔ)上加用PNS-R1會明顯減少BALF中脫落的上皮細胞數(shù)和損傷相關(guān)因子IL-33和TSLP含量,提高氣道上皮細胞完整性。3.Dex治療哮喘小鼠會明顯增加氣道上皮細胞凋亡的百分比以及Caspase3蛋白的表達,在Dex的基礎(chǔ)上加用PNS-R1會明顯減少氣道上皮細胞凋亡的百分比以及Caspase3蛋白的表達。結(jié)論:Dex可以明顯的抑制哮喘小鼠氣道上皮細胞損傷修復(fù),促進氣道上皮細胞凋亡;在使用Dex治療的小鼠中同時使用PNS-R1可以明顯的改善Dex抑制哮喘小鼠氣道上皮損傷修復(fù)的作用,同時減少氣道上皮細胞的凋亡,最終促進哮喘小鼠氣道上皮損傷的修復(fù)。第二部分三七皂苷R1改善糖皮質(zhì)激素抑制支氣管上皮細胞生長的作用研究目的:觀察三七皂苷R1是否可以改善糖皮質(zhì)激素抑制支氣管上皮細胞生長的作用。方法:體外培養(yǎng)人支氣管上皮細胞株16HBE,用Dex和PNS-R1對細胞進行干預(yù)。利用CCK-8技術(shù)檢測細胞生長情況;Transwell實驗和劃痕實驗檢測支氣管上皮細胞的遷移能力;細胞克隆實驗和細胞周期實驗檢測支氣管上皮細胞增殖能力的變化。同時利用TUNEL實驗和流式Annexin-Ⅴ技術(shù)檢測支氣管上皮細胞凋亡情況。Western blot技術(shù)檢測支氣管上皮細胞中凋亡蛋白Caspase3表達情況。結(jié)果:1.Dex明顯抑制16HBE的增殖和遷移,加入PNS-R1干預(yù)后16HBE細胞的遷移和增殖能力明顯增加。2.Dex可以促進16HBE細胞的凋亡,加入PNS-R1干預(yù)后16HBE細胞凋亡明顯減少。3.Dex干預(yù)的細胞中凋亡蛋白Caspase3表達明顯增多,加入PNS-R1干預(yù)的細胞中凋亡蛋白Caspase3較Dex組明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論:Dex可抑制支氣管上皮細胞的遷移和增殖,同時促進支氣管上皮細胞的凋亡;在Dex干預(yù)的16HBE細胞中加入PNS-R1同時干預(yù)可以明顯改善Dex抑制支氣管上皮細胞遷移增殖的作用,同時減少Dex誘導(dǎo)的支氣管上皮細胞凋亡,最終達到促進支氣管上皮生長的作用。第三部分三七皂苷R1通過GRβ影響MAPK信號通路改善糖皮質(zhì)激素抑制哮喘氣道上皮損傷修復(fù)的機制研究目的:探究三七皂苷R1改善糖皮質(zhì)激素抑制哮喘氣道上皮損傷修復(fù)的具體作用機制。方法:收集臨床對哮喘患兒和對照組患兒外周血標(biāo)本,利用Western blot技術(shù)檢測血中單核細胞GRβ蛋白表達情況。利用Western blot、免疫組化、免疫共沉淀等實驗技術(shù)檢測Dex或/和PNS-R1干預(yù)的小鼠哮喘模型肺組織標(biāo)本中糖皮質(zhì)激素受體(GR,Glucocorticoid receptor),MAPK信號通路的變化。慢病毒轉(zhuǎn)染敲低哮喘小鼠體內(nèi)GRβ基因,收取小鼠支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本瑞氏染色后計數(shù)BALF中脫落的細胞數(shù)。收集小鼠氣管及左肺組織進行脫水石蠟包埋切片后,進行HE染色和免疫組化E-cadherin染色,觀察小鼠氣道上皮細胞損傷修復(fù)情況;ELISA檢測肺泡灌洗液中上皮損傷相關(guān)因子含量;同時收集小鼠肝腎組織和血清進行檢測。體外培養(yǎng)16HBE,利用Western blot,免疫組化,免疫共沉淀等實驗技術(shù)檢測Dex或/和PNS-R1干預(yù)的細胞GR,MAPK信號通路的表達情況。然后利用si-RNA敲低細胞中的GRβ后再用Dex或/和PNS-R1對細胞進行干預(yù),利用Transwell實驗和劃痕實驗檢測支氣管上皮細胞的遷移能力;細胞克隆實驗和細胞周期實驗檢測支氣管上皮細胞增殖能力的變化。Western blot技術(shù)檢測MAPK信號通路表達情況。結(jié)果:1.臨床哮喘使用糖皮質(zhì)激素患兒外周血標(biāo)本中GRβ蛋白表達較哮喘未使用糖皮質(zhì)激素組明顯降低,哮喘未使用糖皮質(zhì)激素組較對照組表達也降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2.Dex可明顯抑制16HBE細胞中GRβ表達,減少GRα/GRβ結(jié)合,MAPK信號通路的激活也明顯降低。加入PNS-R干預(yù)后GRβ表達增多,促進GRα/GRβ結(jié)合,進而促進MAPK信號通路的激活。3.敲低16HBE細胞中的GRβ,PNS-R1改善Dex抑制16HBE細胞遷移增殖的能力明顯降低,MAPK信號通路激活明顯降低。4.Dex可明顯抑制哮喘小鼠肺組織和氣道上皮細胞中GRβ表達,加入PNS-R干預(yù)后GRβ表達增多。5.敲低哮喘小鼠體內(nèi)GRβ后PNS-R1改善Dex抑制哮喘小鼠氣道損傷修復(fù)的能力明顯降低。6.PNS-R1腹腔注射的小鼠與空白對照小鼠肝腎功能無差異。結(jié)論:Dex可能通過抑制GRβ表達,減少對GRα的負(fù)性調(diào)節(jié)進而抑制MAPK信號通路的激活,抑制哮喘氣道上皮細胞的損傷修復(fù)。三七皂苷R1可能通過減少Dex對GRβ的抑制作用,使MAPK信號通路的激活增加,進而改善Dex抑制哮喘氣道上皮損傷修復(fù)的作用。
【圖文】：

0%水合氯醛溶液：在 100ml 0.1M 的 PBS 中，加入水合氯醛至固體顆粒完全溶解，，溶液變得透亮為止，避光室溫保存。材料小鼠模型建立及治療 SPF 級雌性 6 周齡 C57bl/6 小鼠隨機分為對照組、哮喘組和 Dex+PNS-R1 組。建立哮喘模型的小鼠于第 0、14 天分別致敏，在第 21-31 天隔天用 30μl HDM 致敏液進行滴鼻激量 10%水合氯醛對小鼠進行鎮(zhèn)靜麻醉，滴鼻完成后觀察到開。對照組在同時間以同等方式給予同等劑量的生理鹽水。.5h 腹腔注射 0.2ml 5mg/kg 的地塞米松溶液，PNS-R1 組在射 0.2ml 15mg/kg 的 PNS-R1 溶液，Dex+PNS-R1 組在每次.2ml 5mg/kg 的地塞米松溶液和 0.2ml 15mg/kg 的 PNS-R1 溶

有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），與 Dex 組相比無差異。Dex+PNS與哮喘組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），同降低，但無統(tǒng)計學(xué)差異。（見圖 2）
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R725.6;R-332

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