【摘要】：目的1、探討染色體微陣列技術(shù)和高通量測序技術(shù)在超聲結(jié)構(gòu)異常家系中的應(yīng)用價值。2、探討RNA-seq測序技術(shù)在ASXL3復(fù)合雜合突變小鼠模型中的應(yīng)用價值。3、探討ASXL3基因的可能作用機(jī)制以及與SOCS3和PSD95之間的相關(guān)關(guān)系。方法1、選取在廣州市婦女兒童醫(yī)療中心產(chǎn)前診斷中心就診的一個連續(xù)生育三胎先天性心臟病的患兒家系,同時收集100例正常健康對照和122例先天性心臟病胎兒病例做擴(kuò)展驗(yàn)證。2、按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程提取胎兒(患兒)的基因組DNA,并使用分光光度計對DNA濃度和純度進(jìn)行測量,符合標(biāo)準(zhǔn)后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、常規(guī)G顯帶染色體核型分析。3、根據(jù)美國Affymetrix公司提供的CytoScan HD芯片平臺的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)操作流程對樣本DNA進(jìn)行消化、連接、擴(kuò)增、片段化、標(biāo)記熒光信號、雜交、洗滌、染色以及芯片掃描。使用CHAS軟件對掃描芯片產(chǎn)生的.CEL文件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,并結(jié)合目前的數(shù)據(jù)庫(DGV、OMIM、DECIPHER、ISCA等)對分析結(jié)果進(jìn)行比對,判斷CNVs的性質(zhì)。4、應(yīng)用全外顯子高通量測序技術(shù)該家系5個樣本進(jìn)行檢測,采用美國Illumina公司的Hiseq 2500高通量平臺進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作,按照操作手冊對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行相應(yīng)處理后,進(jìn)行家系分析及致病基因的篩選,測序數(shù)據(jù)分析采用ClinVar、Exac、HGMD、Mutation Taster、SIFT和PloyPhen等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析。5、用一代測序(Sanger測序)的方法對篩選突變和對照組進(jìn)行驗(yàn)證分析。6、對篩選的突變基因做小鼠模型的構(gòu)建。7、選取構(gòu)建成功后的小鼠大腦、小腦及心臟組織,按照操作流程,進(jìn)行RNA-seq測序分析。并結(jié)合GO分析、KEGG分析及共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析等對篩選的差異表達(dá)基因做關(guān)聯(lián)分析。8、采用神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SK-N-SH)對候選基因做功能驗(yàn)證,按照標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)操作流程,體外培養(yǎng)SK-N-SH細(xì)胞,將慢病毒載體(Lv-control)和表達(dá)ASXL3的重組慢病毒(Lv-siASXL3)分別處理SK-N-SH細(xì)胞,作為對照組和實(shí)驗(yàn)組,通過CCK-8法檢測細(xì)胞增殖,流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡、Western-blot和實(shí)時熒光定量PCR(qPCR)檢測細(xì)胞中SOCS3及PSD95的蛋白和m RNA的表達(dá)情況。結(jié)果1、在先天性心臟病家系中,胎兒染色體核型未檢出異常,染色體微陣列分析(CMA)未檢出明確致病性微缺失或微重復(fù)變異。2、家系做全外顯子測序結(jié)果顯示患者均存在ASXL3基因c.2168CG(p.P723R)和c.5449 CG(p.P1817A)復(fù)合雜合子,而在對父母的分析中發(fā)現(xiàn),父親為c.2168CG(p.P723R)雜合攜帶者,母親為c.5449 CG(p.P1817A)雜合攜帶者。未檢出已知的先天性心臟病相關(guān)基因突變。3、對222例患兒(胎兒)的擴(kuò)展驗(yàn)證中也發(fā)現(xiàn)一例ASXL3基因c.3256CT(p.R1176W)和c.4643AG(p.D1548G)復(fù)合雜合突變,其中患兒父親為c.3256CT(p.R1176W)雜合攜帶者,母親為c.4643AG(p.D1548G)攜帶者。4、通過RNA-seq測序我們發(fā)現(xiàn)復(fù)合雜合突變小鼠中ASXL3的表達(dá)要明顯低于野生對照組,同時檢出了56,917 lncRNAs和16,567 mRNAs,根據(jù)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析,我們發(fā)現(xiàn)了3個lncRNAs(NONMMUT041409.2,NONMMUT047824.2,and NONMMUT135643.1)以及相關(guān)聯(lián)的3個mRNAs(Fos,SOCS3 and Slc6a4)。5、在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,ASXL3干擾后實(shí)驗(yàn)組(Lv-siASXL3)細(xì)胞增殖能力較對照組(Lv-control)無明顯增強(qiáng)。流式細(xì)胞儀結(jié)果也提示ASXL3干擾后實(shí)驗(yàn)組(Lv-siASXL3)細(xì)胞凋亡較對照組(Lv-control)無明顯差異。Western blot和qPCR結(jié)果顯示,ASXL3干擾后可以促進(jìn)SOCS3的表達(dá),同時可以抑制PSD95的表達(dá)。結(jié)論1、染色體微陣列技術(shù)和高通量測序技術(shù)在胎兒結(jié)構(gòu)異常家系分析中有重要的價值。2、RNA-seq測序技術(shù)可以用來探索性的候選基因及其信號通路上與之相互作用的基因。3、ASXL3可以調(diào)控SK-N-SH細(xì)胞中SOCS3和PSD95的表達(dá)。
【圖文】：

圖 1-1 DNA 質(zhì)控電泳圖譜3.5 染色體微陣列分析（CMA）本次實(shí)驗(yàn)采用的是Affymetrix公司提供的CytoScan HD芯片，該芯片包含了1萬個 CNV 探針以及 75 萬個 SNP 探針，在基因內(nèi)平均每 880bp 就含有 1 個探針其中的 CNV 探針幾乎覆蓋了全基因組，對于＞400kb 的基因組拷貝數(shù)變異的檢率達(dá) 99%；而 SNP 探針對 SNP 分型的準(zhǔn)確率＞99%。該探針包含 340 個 ISCA因、526 個癌基因、177 個 X 染色體上的 OMIM 致病性基因，同時覆蓋了 2640的OMIM 致病性基因以及 36121 個 UCSC 數(shù)據(jù)庫的 RefSeq 基因�？删_檢測出貝數(shù)變異（CNVs）、雜合性缺失(LOH)、單親二倍體(UPD)以及低水平的嵌合體樣品異質(zhì)性。目前按照公司提供的標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)操作流程，進(jìn)行全基因組 DNA消化、連接、擴(kuò)增、純化、片段化、標(biāo)記、雜交、掃描以及數(shù)據(jù)分析。具體操作圖1-2。

圖1-3 PCR 產(chǎn)物質(zhì)檢的電泳圖譜PCR 產(chǎn)物純化1 標(biāo)記新的 1.5mL 離心管，將上述 PCR 反應(yīng)后的擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至2 從 4℃冰箱內(nèi)取出磁珠，，上下混勻后分別向各個離心管中加入 7倒混勻 10 次，室溫靜置 10 分鐘，16100 rcf 離心3 分鐘。3 將離心后置于磁力架上，吸去上清液；加入 1ml Purification Wash 沫振蕩器中上下震蕩 2 分鐘；然后 16100 rcf 離心3 分鐘；4 將離心后的離心管置于磁力架上，吸去上清液；16100 rcf 離心 上，待磁珠完全被吸附后，不觸碰磁珠，用 20μl 移液器盡量吸5 打開離心管蓋子，室溫下靜置 10 分鐘，待離心管內(nèi)剩余的液體揮
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R-332

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2657329