【摘要】：旋毛蟲病是一種呈世界性分布的人獸共患寄生蟲病,是由于生食或食用了未熟的感染了旋毛蟲的肉類而感染。人和動物感染旋毛蟲在中國大多數(shù)省份均有報道,旋毛蟲病不僅嚴重威脅公眾健康,同時還影響?zhàn)B豬業(yè)的經濟效益和肉類食品安全。因此,需要發(fā)展疫苗來阻斷旋毛蟲從家養(yǎng)動物向人類的傳播。我們課題組前期應用Western blot和鳥槍法液相色譜質譜聯(lián)用(shotgun LC-MS/MS)技術,使用旋毛蟲感染小鼠及病人的早期血清從成蟲的排泄分泌(ES)蛋白中篩選出了旋毛蟲成蟲特異性DNase II-1(TsDNase Ⅱ-1)/DNase II-7(TsDNase Ⅱ-7)。脫氧核糖核酸酶II(DNase II)是一種廣泛存在的核內切酸酶,可以通過水解DNA的磷酸二酯鍵降解DNA而發(fā)揮其生化功能,并且在逃避宿主免疫防御和病原體入侵過程中發(fā)揮重要作用。DNA疫苗利用真核表達載體,所表達蛋白經過折疊和修飾,比原核表達的蛋白更近似于天然構象。利用減毒鼠傷寒沙門氏菌作為載體,通過口服的方式進行免疫可以更有效地誘導粘膜免疫應答,更有利于殺傷和排出寄生于宿主腸道的蟲體。本研究克隆表達、純化了rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7,免疫小鼠獲得了免疫血清,通過Real-time PCR、Western blot和間接免疫熒光試驗(IIFT)鑒定了TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7在旋毛蟲不同發(fā)育時期的轉錄、表達及定位;觀察了抗rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7免疫血清對旋毛蟲體外侵入腸上皮細胞(IEC)單層的抑制作用及抗rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7特異性抗體介導的巨噬細胞對旋毛蟲新生幼蟲的殺傷作用;構建了減毒沙門氏菌為載體的TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7DNA疫苗,檢測了rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7皮下接種免疫及口服DNA疫苗免疫小鼠的免疫應答類型和對小鼠的免疫保護效果,證實了TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7可作為抗旋毛蟲感染疫苗的候選靶標蛋白。材料與方法1.實驗動物、旋毛蟲蟲種、菌株及細胞系本研究使用的實驗動物為6周齡SPF級雌性BALB/c小鼠,購自河南省實驗動物中心。旋毛蟲蟲種(T1,ISS534)是由本實驗室小鼠每6個月傳代保種。鼠傷寒沙門氏菌"縞yaSL1344株來自河南科技大學動物科技學院動物疫病與公共安全重點實驗室。實驗所用小鼠小腸上皮細胞IEC由本課題組前期分離獲得;乳倉鼠腎細胞BHK-21來自河南省疾控中心細胞資源中心。2.TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7的生物信息學分析及表達與鑒定利用NCBI、ExPasy、BepiPred等在線軟件對TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7的結構域、理化性質及抗原位點進行生物信息學分析;從3d成蟲cDNA中擴增TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7基因并構建原核表達質粒對rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7進行表達和純化,通過Real-time PCR、Western blot和IIFT分析了TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7在旋毛蟲肌幼蟲、腸道感染性幼蟲(IIL)、成蟲和新生幼蟲時期的轉錄、表達及定位。通過體外侵入IEC單層和ADCC實驗觀察TsDNase Ⅱ特異性抗體對旋毛蟲侵入中的作用。3.rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7免疫小鼠誘導的免疫應答將純化的重組蛋白rTsDNase Ⅱ-1、rTsDNase Ⅱ-7、rTsDNase Ⅱ-1+7混合蛋白、佐劑及PBS分別皮下注射免疫小鼠。初次免疫后0、10、20和30d尾靜脈采血收集小鼠血清,運用間接ELISA方法檢測并分析rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7免疫小鼠后引起IgG、IgG1和IgG2a水平的變化。4.TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7重組沙門氏菌DNA疫苗的構建及鑒定構建真核重組質粒pcDNA3.1-TsDNase Ⅱ-1和pcDNA3.1-TsDNase Ⅱ-7,用脂質體法將其轉入BHK-21細胞中,用RT-PCR和IIFT鑒定質粒在體外的轉錄和表達。將重組質粒用電轉法轉化進入減毒沙門氏菌后口服免疫小鼠,免疫后1周采集小鼠脾臟和腸系膜淋巴結,用RT-PCR和IIFT鑒定質粒在小鼠體內的轉錄和表達。5.TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7 DNA疫苗免疫小鼠誘導的免疫應答收集DNA疫苗初次免疫后0、10、20和30d的小鼠血清、腸道沖洗液、脾細胞和腸系膜淋巴結細胞。采用ELISA法檢測小鼠血清特異性抗體IgG、IgG1、IgG2a的水平和腸液中總IgA、特異性IgA水平。將脾細胞和腸系膜淋巴結細胞分別用rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7刺激72h,收集細胞培養(yǎng)上清,采用雙抗體夾心ELISA法檢測細胞因子(IFN-γ、IL-4、IL-10)的水平。此外,應用IIFT檢測免疫小鼠血清IgG和腸道沖洗液IgA對旋毛蟲不同發(fā)育時期蟲體的識別,進一步驗證DNA疫苗所引起的免疫應答。6.rTsDNase Ⅱ及DNA疫苗免疫對小鼠的免疫保護作用分別用皮下注射rTsDNase Ⅱ和口服DNA疫苗2種途徑免疫小鼠,末次免疫后10d,每只小鼠經口感染300條旋毛蟲肌幼蟲。攻擊感染后5d剖殺小鼠,收集腸道成蟲并計算成蟲減蟲率;感染后42 d剖殺小鼠收集肌幼蟲并計算肌幼蟲減蟲率,以觀察免疫保護效果。7.統(tǒng)計學處理使用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析統(tǒng)計。數(shù)值的表述方式為平均值±標準差。多個實驗組之間的比較運用單因素方差分析,兩組間比較使用t檢驗和卡方檢驗,檢驗顯著性水平:α=0.05。結果1.TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7的生物信息學分析及表達與鑒定測序結果表明,TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7的完整cDNA序列分別為1221 bp和1161bp,預測的開放閱讀框分別編碼347和348個氨基酸,分子量大小分別為38.06 kDa和38.22 kDa,等電點分別為7.58和7.56。Western blot分析結果顯示,IIL、成蟲、新生幼蟲粗提蛋白和成蟲ES蛋白中的天然TsDNase Ⅱ-1或TsDNase Ⅱ-7可以被抗rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7的血清識別。Real-time PCR結果表明,TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7在旋毛蟲各發(fā)育期蟲體均有轉錄;IIFT結果顯示,TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7在成蟲和新生幼蟲蟲體表面均有表達,并且主要位于蟲體組織切片的表皮和桿狀體。經抗rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7血清孵育的IIL,體外對腸上皮細胞的侵入率分別為40.13%和32.65%,明顯低于免疫前血清組(4.01%,χ_1~2=105.012,χ_2~2=70.118,P0.01);ADCC結果顯示,抗rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7血清組的新生幼蟲死亡率(66.84%和63.39%)明顯高于免疫前血清組(15.30%,t_1=26.420,t_2=22.599,P0.01),對新生幼蟲的這種細胞毒性具有抗體劑量依賴性(F_1=69.569,F_2=68.231,P0.01)。2.rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7免疫小鼠誘導的免疫應答rTsDNase Ⅱ-1、rTsDNase Ⅱ-7和2種蛋白混合免疫小鼠均可產生高滴度的血清特異性抗體,且rTsDNase Ⅱ-1(t_(20d)=13.318,t_(30d)=56.608,P0.01)、rTsDNase Ⅱ-7(t_(20d)=17,507,t_(30d)=22.466,P0.01)和2種蛋白混合(t_(20d)=7.821,t_(30d)=24.942,P0.01)免疫小鼠后20和30 d,血清IgG1水平均明顯高于IgG2a水平,表明rTsDNase Ⅱ免疫小鼠后引起了以Th2型為主的Th1/Th2混合型免疫應答。3.TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7重組沙門氏菌DNA疫苗的構建及鑒定雙酶切和測序驗證結果證明成功構建了△cyaSL1344/pcDNA3.1-TsDNase Ⅱ-1和△cyaSL1344/pcDNA3.1-TsDNase Ⅱ-7 DNA疫苗。體外轉染BHK-21細胞后,RT-PCR和IIFT檢測結果顯示轉染細胞中存在TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7基因轉錄和蛋白表達。對DNA疫苗免疫1周后的小鼠脾臟和腸系膜淋巴結進行RT-PCR和IIFT實驗,結果表明經口免疫TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7 DNA疫苗,TsDNase Ⅱ在脾臟和腸系膜淋巴結中成功轉錄和表達。4.TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7 DNA疫苗免疫小鼠誘導的免疫應答小鼠經ΔcyaSL1344/pcDNA3.1-TsDNase Ⅱ-1和ΔcyaSL1344/pcDNA3.1-TsDNase Ⅱ-7第2次和第3次免疫后,血清特異性IgG水平均有明顯升高,且IgG1水平明顯高于IgG2a水平(P0.01);腸道沖洗液中總IgA和特異性IgA也均有明顯的升高。在初次免疫后10d、20d和30d,小鼠脾細胞和腸系膜淋巴結細胞經rTsDNase Ⅱ-1或rTsDNase Ⅱ-7刺激后,IFN-γ、IL-4和IL-10水平明顯高于空質粒組和PBS組(P0.01),表明TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7 DNA疫苗免疫小鼠后引起了Th1/Th2免疫應答,并誘導了粘膜免疫應答。5.rTsDNase Ⅱ及DNA疫苗免疫對小鼠的免疫保護作用rTsDNase Ⅱ-1免疫組的成蟲減蟲率(40.36%)明顯高于rTsDNase Ⅱ-7免疫組(34.86%)(t=2.480,P0.05);2個免疫組的肌幼蟲減蟲率(50.43%vs 42.33%)的差異無統(tǒng)計學意義(t=1.008,P0.05)。TsDNase Ⅱ-1 DNA疫苗組的成蟲減蟲率(53.85%)亦明顯高于TsDNase Ⅱ-7 DNA疫苗組(46.15%)(t=3.253,P0.05),2個免疫組的肌幼蟲減蟲率(59.26%vs53.41%)的差異也無統(tǒng)計學意義(t=1.685,P0.05)。結果表明,rTsDNase Ⅱ蛋白和DNA疫苗免疫接種均對小鼠產生了部分免疫保護效果。TsDNase Ⅱ-1或TsDNase Ⅱ-7 DNA疫苗免疫的小鼠,腸道成蟲減蟲率明顯高于rTsDNase Ⅱ蛋白免疫組(t_1=2.670,t_2=2.812,P0.05);TsDNase Ⅱ-1或TsDNase Ⅱ-7 DNA疫苗口服免疫小鼠的肌幼蟲減蟲率與rTsDNase Ⅱ-1或rTsDNase Ⅱ-7蛋白免疫組相比差異無統(tǒng)計學意義(t_1=1.641,t_2=1.429,P0.05)。結論1.成功構建了pQE-80L-TsDNase Ⅱ-1/7重組表達質粒,并表達了rTsDNase Ⅱ-1/7蛋白;TsDNase Ⅱ-1/7在旋毛蟲不同發(fā)育時期均有轉錄,在除肌幼蟲外的各發(fā)育時期均有表達,主要定位在蟲體的皮層、桿狀體和胚胎。2.構建了△cyaSL1344/pcDNA3.1-TsDNase Ⅱ-1/7 DNA疫苗,2種DNA疫苗免疫小鼠均引起了以Th2型為主的Th1/Th2混合型免疫應答以及特異性的黏膜免疫應答。3.TsDNase Ⅱ-1/7 DNA疫苗口服或rTsDNase Ⅱ皮下注射免疫小鼠均可產生對旋毛蟲感染的部分免疫保護作用,各免疫組間肌幼蟲減蟲率的差異無統(tǒng)計學意義,但TsDNase Ⅱ-1 DNA疫苗免疫小鼠后成蟲的減蟲率明顯高于TsDNase Ⅱ-7 DNA疫苗組及rTsDNase Ⅱ蛋白免疫組。4.TsDNase Ⅱ為旋毛蟲侵入相關蛋白并可作為旋毛蟲疫苗的候選靶向分子。
【圖文】：

密碼子（ATG）到 1044 位終止密碼子（TAA），編碼 347 個氨基酸，1045bp 到 1221bp為 3’UTR（非編碼區(qū)）。預測其分子質量為 38.06kDa，，等電點為 7.58；不穩(wěn)定指數(shù) 38.34，認為該蛋白穩(wěn)定，脂肪指數(shù)是 82.45，總平均親水性是 0.097，認為 TsDNaseII-1 蛋白為親水性蛋白。使用 Protscale 程序 Hphob./Kyte and Doolittle 方法預測 TsDNase II-1 蛋白疏水性分析顯示，該蛋白在 5’N 端有明顯疏水性區(qū)域（圖 1.1a）。TsDNaseII-1 蛋白無跨膜區(qū)，1-18 位氨基酸為信號肽序列，證明 TsDNaseII-1 為分泌性蛋白，其成熟的肽段始于第 19 位氨基酸（圖 1.2 a）。TsDNase II-7（GenBank: AY963701.1），序列全長 1161 bp，其中從 4bp 起始密碼子（ATG）到 1050bp 終止密碼子（TAA），編碼 348 個氨基酸，1051bp 到 1161bp 為 3’UTR。預測其分子質量為 38.22kDa，等電點為 7.56；不穩(wěn)定指數(shù) 37.96，認為該蛋白穩(wěn)定，脂肪指數(shù)是 85.83，總平均親水性是 0.052，認為 TsDNase II-7 蛋白為親水性蛋白。使用Protscale 程序 Hphob./Kyte and Doolittle 方法預測 TsDNase II-7 蛋白疏水性分析顯示，該蛋白在 5’N 端有明顯疏水性區(qū)域（圖 1.1b）。TsDNaseII-7 蛋白無跨膜區(qū)，1-18 位氨基酸為信號肽序列，證明 TsDNase II-7 為分泌性蛋白，其成熟的肽段始于第 19 位氨基酸（圖 1.2 b）。

圖 1.2 TsDNase II-1（a）及 TsDNase II-7（b）蛋白信號肽預測2.1.2 二級結構、三級結構及結構域預測使用在線軟件 PSIPREDv3.3（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）預測蛋白二級結構。預測結果顯示，TsDNase II-1 蛋白的二級結構包含有 7 個 α-螺旋、15 個 β-折疊、24 個無規(guī)則卷曲（圖 1.3）。NCBI 結構域預測顯示，TsDNase II-1 包含在第 19-155 位之間是一個 PLDc_DNaseII_1 結構域，第 22-340 位之間是一個完整的 DNaseII 結構域（圖1.5）。TsDNase II-7 蛋白的二級結構包含有 8 個 α-螺旋、7 個 β-折疊、15 個無規(guī)則卷曲（圖 1.4）。結構域預測顯示，TsDNase II-7 包含在第 20-154 位之間是一個PLDc_DNaseII_1 結構域，第 22-341 位之間是一個完整的 DNaseII 結構域（圖 1.5）。使用 SWISS-MODEL 同源模建軟件對 TsDNase II-1（圖 1.6 a）及 TsDNase II-7（圖 1.6 b）蛋白的三級結構。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R383.15

【參考文獻】

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1 李蓮瑞;吳秀萍;付寶權;盧強;王學林;劉明遠;;旋毛蟲新生幼蟲脫氧核糖核酸酶Ⅱ基因家族的篩選和分析[J];吉林農業(yè)大學學報;2009年02期

本文編號：2657029