【摘要】：大腸埃希菌O157:H7是一種重要的食源性致病菌,可引起嚴(yán)重的腹瀉,出血性結(jié)腸炎和溶血性尿毒綜合癥。大腸埃希菌O157的污染已成為影響全球食品公共安全的重要因素。世界各地每年都會(huì)有因食用大腸埃希菌O157污染的蔬菜肉類而導(dǎo)致腹瀉甚至死亡的疫情爆發(fā),然而傳統(tǒng)食品滅菌劑已不能滿足日趨嚴(yán)重食品安全問題。噬菌體因其特異的滅菌方式漸漸受到人們的關(guān)注。本研究以大腸埃希菌O157為宿主菌,從醫(yī)院污水中篩選出兩株裂解性噬菌體,分別命名為FEC14,FEC19。生物學(xué)特性研究結(jié)果表明:兩株噬菌體均是裂解性強(qiáng),宿主譜寬,穩(wěn)定性高的肌尾病毒科噬菌體,但它們卻有明顯的不同。透射電子顯微鏡顯示噬菌體FEC19有一個(gè)直徑約58nm±3nm的正20面體頭部和可收縮的尾部,尾絲為針狀,而噬菌體FEC14的頭部直徑約80nm±5nm,尾絲呈現(xiàn)星狀。噬菌體FEC14比噬菌體FEC19的裂解譜更寬:噬菌體FEC14能夠裂解全部14株大腸埃希菌O157,噬菌體FEC19卻只能裂解11株大腸埃希菌O157。噬菌體FEC14和FEC19的最佳感染復(fù)數(shù)分別為0.001和0.1,潛伏期分別為15min和10min,生長(zhǎng)期分別為65min和80min。噬菌體FEC14比FEC19對(duì)溫度更加敏感。70℃時(shí)噬菌體FEC14逐漸在40min內(nèi)喪失全部活力,而噬菌體FEC19在80℃下20min時(shí)才完全失活。噬菌體FEC14在酸堿環(huán)境下比噬菌體FEC19的穩(wěn)定性要高。噬菌體FEC14在pH 3-12條件下仍有活性,而噬菌體FEC19只能在pH 4-11的條件下存活。噬菌體FEC19的基因可被3種限制性核酸內(nèi)切酶(EcoRⅤ,HindⅢ,XbaⅠ)切開,噬菌體FEC14不能被實(shí)驗(yàn)室常用的十種核酸內(nèi)切酶切開。推測(cè)其原因?yàn)槭删wFEC14的DNA被修飾導(dǎo)致基因組對(duì)限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生抗性。噬菌體FEC14和FEC19進(jìn)行全基因組測(cè)序并分別上傳至Genbank,序列號(hào)為MG383452和MH816966。由于噬菌體FEC14比噬菌體FEC19的基因信息含量大且豐富,因此只選取噬菌體FEC14的基因組進(jìn)行深入分析。噬菌體FEC14的基因組全長(zhǎng)158639bp,GC含量為44.6%,基因組含有210個(gè)ORF,4個(gè)tRNA,其中預(yù)測(cè)為已知功能的ORF有73個(gè),目前尚未檢測(cè)出毒力基因和耐藥基因。進(jìn)化分析顯示它屬于肌尾噬菌體科,Tevenvirinae亞科,Vilvirus屬�？偨Y(jié)出該屬噬菌體有著區(qū)別于其他肌尾噬菌體的顯著特征包括:噬菌體的形態(tài)、基因組大小、基因同線形、使用非規(guī)范堿基等。對(duì)兩株噬菌體在人工污染牛肉上殺菌效果進(jìn)行評(píng)估,結(jié)果顯示:在染菌牛肉上單獨(dú)使用FEC14、FEC19噬菌體或雞尾酒法都能有效的降低宿主菌數(shù)量,其中噬菌體FEC19的防控效果強(qiáng)于噬菌體FEC14,4℃的防控效果強(qiáng)于室溫,單一施用噬菌體與雞尾酒法防控效果相當(dāng),但考慮宿主菌耐受問題,最好選用雞尾酒法進(jìn)行宿主菌的防控。綜上,本實(shí)驗(yàn)得到的兩株裂解性噬菌體FEC14和FEC19在控制食品中大腸埃希菌O157污染的應(yīng)用中具有很大潛力,將來可以開發(fā)為產(chǎn)品用于食品安全領(lǐng)域。
【圖文】：

對(duì)其基因組進(jìn)行測(cè)序和深入分析，從而擴(kuò)大我們對(duì)噬菌體多樣性和進(jìn)化關(guān)系的認(rèn)識(shí)。1.2.2 噬菌體作用機(jī)制噬菌體作用宿主菌的第一步就是吸附，宿主菌表面存在特定的受體(如脂多糖、磷壁酸、鞭毛等)是噬菌體感染細(xì)菌所必需的。這些受體的多樣性決定著噬菌體感染宿主菌的特異性。同時(shí)，細(xì)菌的類型、生長(zhǎng)環(huán)境、毒力等因素也會(huì)影響噬菌體吸附在宿主菌表面[31]。當(dāng)噬菌體吸附到細(xì)菌表面受體后，噬菌體會(huì)釋放裂解酶來溶解細(xì)菌細(xì)胞壁，，從而將其遺傳物質(zhì)注入細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。根據(jù)噬菌體的類型，噬菌體會(huì)以兩種途徑在宿主菌體內(nèi)增殖(如圖 1)：一種是裂解性噬菌體主導(dǎo)的裂解途徑；另一種是溫和噬菌體主導(dǎo)的溶原途徑。

A18 Sheep + + + + - -A19 Human + + + + + +A20 Human + + + + + +C1 Chicken + + + + + +E1 Food + + + + + +注：“+”為陽性結(jié)果；“-”為陰性結(jié)果；“*”為未知。(2) 產(chǎn)志賀毒素基因 stx1 和 stx2 的鑒定志賀毒素基因（stx1 和 stx2）編碼的志賀樣毒素是細(xì)菌最主要的毒力因子，志賀毒素基因的存在大大增加了細(xì)菌的致病性。本實(shí)驗(yàn)將 14 株含有 O157：H7抗原的大腸埃希菌進(jìn)行 PCR 檢測(cè)產(chǎn)志賀毒素基因 stx1(614bp)和 stx2(779bp)。其中有 4 株存在產(chǎn)志賀毒素基因 stx1 和 stx2 缺失，其它 10 株均含有毒素基因，詳細(xì)結(jié)果見圖 2.1，圖 2.2，表 2.3。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R378.2


本文編號(hào)：2656698