鴨乙型肝炎病毒環(huán)介導等溫擴增檢測系統(tǒng)的建立及其基因組序列分析

發(fā)布時間：2020-05-09 01:45

【摘要】：鴨乙型肝炎病毒與人乙肝病毒同屬嗜肝DNA病毒科,它們在病毒的結(jié)構(gòu)、病毒的復制過程、感染宿主機制和致病機制等方面比較類似,因而以鴨乙型肝炎病毒為動物感染模型對研究嗜肝病毒的復制周期并抑制病毒復制大有助益,DHBV體外感染原代鴨肝細胞模型和體內(nèi)感染動物模型還可用來研究病毒基因的作用以及篩選治療藥物。本研究通過建立一種新型的環(huán)介導等溫擴增檢測系統(tǒng),利用其特異性強、靈敏度高、快速簡便的特點,優(yōu)化構(gòu)建出一套即能簡化操作流程,又能滿足快速檢測需要的適用于基層單位及實地現(xiàn)場檢測的檢測系統(tǒng)。并通過不斷地優(yōu)化LAMP體系各組分配比和反應條件,建立一個最佳的能夠特異檢測鴨乙型肝炎病毒的LAMP反應體系,使鴨乙型肝炎病毒可以在基層環(huán)境大規(guī)模大批量被檢測出來。經(jīng)過大量的實驗,得到了鴨乙型肝炎LAMP檢測系統(tǒng)的最優(yōu)化條件為:1.酚紅和甲酚紅混合染色液作為顯色試劑,陽性結(jié)果顯示為亮黃色,陰性結(jié)果顯示為紫紅色。顏色差別大,利于觀察判定結(jié)果;2.通過設(shè)置梯度實驗選擇最佳Mg離子濃度,發(fā)現(xiàn)體系中Mg離子濃度為6mM時,擴增效果最好;3.通過調(diào)節(jié)dNTPs濃度發(fā)現(xiàn),當dNTPs濃度為1.2 mM時,擴增效果最好;4.對LAMP體系進行時間梯度實驗時,可觀察到反應時間為50 min的電泳圖條帶最為明亮,擴增效果最好,因此選擇反應50 min為最佳反應時間;5.進行LAMP溫度梯度實驗時,發(fā)現(xiàn)反應溫度為63℃、64℃、65℃時,電泳膠圖泳帶都較為明亮,擴增效果較好,最后選擇Bst DNA聚合酶的最佳酶活溫度65℃作為反應的最優(yōu)溫度。利用優(yōu)化好的LAPM檢測系統(tǒng)批量檢測河南南陽、安徽亳州、湖北潛江三地鴨場采集的鴨血清樣本,篩選出攜帶DHBV病毒的陽性樣本。結(jié)果顯示,河南南陽、安徽亳州、湖北潛江三地的鴨乙型肝炎感染率分別為17.6%、13.6%、16.1%,差異統(tǒng)計學不顯著(P0.05)。從三地的DHBV陽性樣本中各挑選1份進行DHBV全基因的克隆、測序和序列分析,河南南陽、安徽亳州、湖北潛江3株DHBV分離株基因組全長分別為3024、3027、3024 bp。序列分析數(shù)據(jù)顯示3株DHBV間核苷酸同源性為95.1%~97.4%,與選取的25株參考株同源性為90.3%~96.2%。遺傳進化樹和P蛋白氨基酸關(guān)鍵位點分析證明,河南南陽、安徽亳州2株分離株為類中方基因型,湖北潛江分離株不屬于中方型和西方型兩大分支,屬于獨立小分支,可能產(chǎn)生了病毒重組。
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