【摘要】：肝臟是人體重要的物質(zhì)代謝器官。肝細(xì)胞中的物質(zhì)代謝是一個復(fù)雜的過程,受到各種內(nèi)外因素的調(diào)控,其中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮重要作用。肝臟天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、谷氨酸脫氫酶(GDH)、谷氨酸脫羧酶(GAD)、鳥氨酸脫羧酶(ODC)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)和α-酮戊二酸脫氫酶(OGDH)等氨基酸代謝關(guān)鍵酶的含量反映肝臟的健康狀態(tài),但這些酶的表達(dá)調(diào)控機(jī)制并不十分清楚。mTORC1和mTORC2是細(xì)胞生長、代謝的中心協(xié)調(diào)器,目前對二者在肝細(xì)胞氨基酸代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)調(diào)控中的作用了解還很少。本研究首先以人正常肝細(xì)胞(HL-7702)和肝腫瘤細(xì)胞(HepG2)為模型,比較兩種細(xì)胞中氨基酸代謝所涉及6種關(guān)鍵酶的表達(dá)差異;隨之以HL-7702細(xì)胞為模型,研究mTORC1和mTORC2在氨基酸代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)調(diào)控中的作用與機(jī)制;最后通過比較分析,確定mTORC1和mTORC2在調(diào)控氨基酸代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)中的不同作用。實(shí)驗利用RT-qPCR檢測目的基因的mRNA水平,ELISA檢測酶含量,Western blot檢測mTORC1、mTORC2和轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、STAT3活性變化。結(jié)果表明:(1)人正常肝細(xì)胞HL-7702細(xì)胞內(nèi)AST、OGDH、GDH的含量顯著高于肝癌細(xì)胞HepG2(p0.01),而GAD、ODC、GST顯著低于HepG2(p0.01);HL-7702細(xì)胞培養(yǎng)液中AST、OGDH、GDH、GAD、ODC和GST含量低于HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液中的含量;(2)Rapamycin處理HL-7702細(xì)胞,顯著抑制mTORC1信號通路相關(guān)蛋白mTOR、S6和4EBP1的磷酸化水平,AST、OGDH、GDH、GAD、ODC和GST基因的mRNA水平顯著減低(p0.01),細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)液中酶含量顯著下降(p0.01);(3)HL-7702細(xì)胞轉(zhuǎn)錄后沉默Raptor基因,和對照組相比,mTOR、S6和4EBP1的磷酸化水平明顯降低,AST、OGDH、GDH、GAD、ODC和GST基因mRNA水平顯著降低(p0.01),細(xì)胞內(nèi)酶含量顯著減少(p0.01);(4)HL-7702細(xì)胞過表達(dá)Rheb基因,和對照組相比,mTOR、S6和4EBP1的磷酸化水平升高,AST、OGDH、GDH、GAD、ODC和GST基因mRNA水平顯著升高(p0.01),細(xì)胞內(nèi)酶含量明顯升高(p0.01);(5)谷氨酸信號激活HL-7702細(xì)胞mTORC1信號通路,轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活性增強(qiáng),但對轉(zhuǎn)錄因子STAT3活性無影響;外源谷氨酸提高細(xì)胞AST基因mRNA水平(p0.01)和酶含量(p0.01);(6)鳥氨酸信號激活HL-7702細(xì)胞mTORC1信號通路,增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活性,對STAT3活性無影響,細(xì)胞ODC基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)(p0.05),酶含量增加(p0.05);(7)HL-7702細(xì)胞轉(zhuǎn)錄后沉默Rictor基因,mTORC2信號通路相關(guān)蛋白mTOR和AKT的磷酸化水平下降,AST、OGDH、GDH、GAD、ODC和GST基因mRNA水平顯著降低(p0.01),細(xì)胞內(nèi)酶含量顯著下降(p0.01);(8)HL-7702細(xì)胞過表達(dá)mTORC2關(guān)鍵組分mSIN1編碼基因mSIN1,mTOR和AKT的磷酸化水平升高,AST、OGDH、GDH、GAD、ODC和GST基因mRNA水平顯著升高(p0.01),細(xì)胞內(nèi)酶含量明顯升高(p0.01);(9)對比mTORC1和mTORC2對HL-7702細(xì)胞氨基酸代謝6種關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響,mTORC1的調(diào)控作用強(qiáng)于mTORC2。綜上所述,AST、OGDH、GDH、GAD、ODC和GST等氨基酸代謝關(guān)鍵酶含量在人正常肝細(xì)胞HL-7702與肝腫瘤細(xì)胞HepG2中的合成與分泌存在差別,HepG2分泌6種酶的能力強(qiáng)于HL-7702,為以后利用這些酶含量變化預(yù)測肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。HL-7702細(xì)胞中,mTORC1調(diào)節(jié)氨基酸代謝相關(guān)關(guān)鍵酶基因AST、OGDH、GDH、GAD、ODC和GST表達(dá)和酶分泌;mTORC1介導(dǎo)谷氨酸或鳥氨酸信號,通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活性調(diào)節(jié)AST或ODC表達(dá)。mTORC2也參與上述6個基因的表達(dá),其調(diào)控作用相對弱于mTORC1。研究結(jié)果展示了肝細(xì)胞中氨基酸代謝關(guān)鍵酶基因的表達(dá)調(diào)控模型,對進(jìn)一步了解肝臟中氨基酸的代謝機(jī)制,為臨床靶向治療肝臟疾病提供一定的科學(xué)依據(jù)。
【圖文】：

他蛋白相結(jié)合，形成兩種不同蛋白復(fù)合物 mTORC1TOR Complex 2），，兩種蛋白質(zhì)復(fù)合物調(diào)節(jié)不同的細(xì)胞圖 1.1 mTOR 的蛋白結(jié)構(gòu)Fig. 1.1 The protein structure of mTOR

mTORC1的組成
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R329.2

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本文編號：2654780