【摘要】：研究背景盆腔器官脫垂(Pelvic organ prolapse,POP)是全球性的健康問題,可造成行走不適,或排尿、排便及性生活功能障礙,嚴重影響女性的生活質(zhì)量。陰道及其支持結(jié)締組織的完整性對于盆腔臟器正常解剖位置及功能的維持是至關重要的。人體陰道是由四層結(jié)構(gòu)組成的纖維肌肉管腔,其中富含Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白的固有層和平滑肌層是陰道的兩層重要結(jié)構(gòu),為陰道壁提供抗張力。這些結(jié)構(gòu)成分的變化可導致陰道壁生物力學特征的變化,進而導致POP的發(fā)生。然而,POP患者陰道壁組織結(jié)構(gòu)變化的相關研究還比較少見,且僅有的一些研究結(jié)論仍不一致。因此,在本研究中,我們首先收集了病例組POP患者及對照組非POP的陰道壁組織,通過比較分析,進一步揭示POP患者陰道壁組織結(jié)構(gòu)及細胞成分的變化情況。其次,POP的病理生理學機制目前仍不清楚。探索合適的動物模型不僅有利于提高我們對POP病因?qū)W及疾病自然進展的認識,而且對于研發(fā)POP的新型治療手段同樣具有重要意義。陰道分娩、絕經(jīng)、年老是POP發(fā)生的主要高危因素。因此,本研究構(gòu)建了 SD大鼠手術絕經(jīng)模型,首次全面分析了短期及長期絕經(jīng)后大鼠陰道前壁組織形態(tài)學、生化及生物力特征的變化,來判斷該模型是否為研究POP新型療法的適宜動物模型。此外,非人靈長類動物一直被認為是研究POP的最佳動物模型,但相關研究的基礎資料仍十分薄弱,我們又進一步對年老經(jīng)產(chǎn)雌性恒河猴自發(fā)POP的患病率進行調(diào)查,為日后以恒河猴作為POP研究的理想動物模型提供更多的信息支撐。第三,組織工程技術的發(fā)展為重建受損組織或器官提供了更多的選擇。近年來,不同來源的間充質(zhì)干細胞在壓力性尿失禁的臨床前動物實驗及臨床研究中己得到廣泛使用。遺憾的是,使用干細胞來治療POP的研究目前仍非常少見。本研究基于我們構(gòu)建的手術絕經(jīng)SD大鼠模型,將人臍帶間充質(zhì)干細胞(Human Umbilical cord Mesenchymal Stem Cells,HUMSCs)注射至大鼠陰道前壁,觀察其在陰道壁膠原蛋白及平滑肌組織的修復及再生過程中的作用,以探究HUMSCs是否有助于絕經(jīng)后大鼠的陰道壁恢復至正常結(jié)構(gòu),為POP組織工程技術的研發(fā)提供理論基礎。研究方法1.標本收集及組織形態(tài)學分析:選擇2018年6月到2018年12月在北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科接受陰式子宮切除+盆底重建手術的重度陰道前壁膨出(Ⅲ/Ⅳ度)患者為病例組,同期因非POP的婦科良性疾病行子宮切除手術的患者為對照組。病例組所取標本為患者陰道前壁膨出最重部位的陰道全層;對照組取穹窿處陰道前壁全層組織。通過組織切片染色,免疫組化及免疫熒光染色方法檢測陰道前壁Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白、平滑肌含量及成纖維細胞的變化。2.動物模型構(gòu)建:首先通過切除SD大鼠雙側(cè)卵巢制作絕經(jīng)模型,使用組織學染色、免疫組化、Western blot、單軸生物力檢測等方法了解絕經(jīng)后2周、4周及16周大鼠陰道前壁Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白、平滑肌及相應生物力的改變;此外進一步對34只年老經(jīng)產(chǎn)恒河猴進行POP-Q分度檢查,了解恒河猴自發(fā)性POP的患病率。3.組織工程技術修復:使用手術絕經(jīng)SD大鼠模型,分為4組:生理鹽水組、膠原蛋白組、生理鹽水+HUMSCs組、膠原蛋白+HUMSCs組。分別將生理鹽水、2mg/ml膠原蛋白溶液、3×106MSCs生理鹽水懸液或3×l06MSCs膠原蛋白懸液各0.3ml注射至大鼠陰道前壁,并在注射后2周、4周及12周取材。通過小動物活體成像、組織形態(tài)學分析、定量PCR、單軸生物力檢測等方法探究人臍帶間充質(zhì)干細胞細胞在體內(nèi)的存活時間、轉(zhuǎn)化發(fā)生情況及對絕經(jīng)后大鼠陰道前壁組織結(jié)構(gòu)及生物力的修復作用。研究結(jié)果1.POP患者陰道前壁組織形態(tài)學變化:病例組膠原蛋白排列疏松,紊亂;而對照組排列密集,有序。病例組Ⅰ型膠原蛋白含量顯著低于對照組(16.65±6.63%vs25.27±5.54%,P0.001)。兩組間的Ⅲ型膠原蛋白含量及Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白含量比值無顯著性差異。相較于對組照,病例組的肌層平滑肌束變細,排列紊亂,且肌層平滑肌含量顯著下降(26.04±4.36%vs44.74±5.65%,P0.001)。對照組陰道壁固有層成纖維細胞呈長的紡錘體型,而病例組轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形。病例組每高倍視野下陰道壁固有層成纖維數(shù)量較對照組顯著減少(37.0±11.7vs47.5±8.3,P0.001)。2.SD大鼠手術絕經(jīng)模型構(gòu)建及恒河猴自發(fā)POP患病率研究:自手術絕經(jīng)第2周起,大鼠的陰道前壁發(fā)生了持續(xù)的變化。較之于對照組,處理組上皮萎縮,Ⅰ型膠原蛋白逐漸增多,變化具有顯著性(P0.001),Ⅲ型膠原蛋白呈下降趨勢,肌層平滑肌含量逐漸下降,以16周后變化最為顯著(P0.001)。單軸生物力檢測顯示手術絕經(jīng)后16周,陰道前壁線性區(qū)域彈性模量較對照組顯著增加(0.74±0.27 MPa versus 0.25±0.11 MPa,P=0.016)。動物查體中,年老經(jīng)產(chǎn)恒河猴中自發(fā)性POP的患病率為11.8%。3.HUMSCs對SD大鼠絕經(jīng)后陰道壁的修復作用:小動物活體成像顯示MSCs細胞信號在一周內(nèi)消失。注射后2周,膠原蛋白+HUMSCs組仍可見少量DIR標記的MSCs散在分布于陰道壁的固有層及肌層。注射至陰道壁的MSCs未發(fā)生轉(zhuǎn)化。注射后4周及12周,注射MSCs的兩組較未注射細胞組,Ⅰ型膠原蛋白均顯著減少,Ⅲ型膠原蛋白均顯著增多,Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白比值均明顯下降,P值均0.001。注射后12周,注射MSCs的兩組肌層平滑肌含量均顯著高于未注射細胞組(P0.001)。注射后2周和4周,膠原蛋白+HUMSCs組的ACTA2基因表達水平均顯著高于生理鹽水組(P=0.042及P=0.040)。在不同時間點,注射MSCs組促血管生成的生長因子(bFGF或VEGF)的基因表達水平均顯著高于未注射細胞組。12周時,膠原蛋白+HUMSCs組的線性區(qū)域剛度顯著低于生理鹽水組(0.71±0.40 N/mm vs 2.32±0.97 N/mm,P=0.025)。研究結(jié)論1.POP患者陰道前壁膠原蛋白排列疏松、紊亂,Ⅰ型膠原蛋白含量顯著降低;肌層平滑肌束變細,排列紊亂,且平滑肌含量顯著下降;固有層成纖維細胞形態(tài)發(fā)生改變,且數(shù)量明顯減少。2.大鼠陰道壁的組織結(jié)構(gòu)與人類相似,手術絕經(jīng)2周后大鼠陰道壁的Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白及平滑肌可發(fā)生持續(xù)的改變,手術絕經(jīng)大鼠可作為POP新型治療手段研究的動物模型,但與人體不同的是,正常SD大鼠陰道前壁固有層以Ⅲ型膠原蛋白為主,并非最理想的動物模型。3.非人類靈長動物恒河猴體態(tài)、生殖生理及妊娠分娩過程與人類最為相似,年老經(jīng)產(chǎn)的恒河猴中自發(fā)性POP的患病率為11.8%,為POP研究的更合適的動物模型。4.HUMSCs注射至大鼠陰道前壁后,可將絕經(jīng)大鼠的陰道前壁的組織成分及生物力恢復至正常,干細胞有望成為治療POP這種退行性疾病的新型治療手段;HUMSCs在體內(nèi)發(fā)揮組織修復功能主要是通過分泌作用而非轉(zhuǎn)化作用。
【圖文】：

三．天狼猩紅染色顯示病例組及對照組Ｉ／ＩＩＩ型膠原蛋白在固有層的含量及比例的變化逡逑在偏振光鏡頭下，可以觀察到固有層膠原蛋白束呈混合性的雙折射染色，從綠色到逡逑黃色、橙色及紅色（圖１）。綠色膠原蛋白束為較細的ＩＩＩ型膠原蛋白，而橙黃及紅色膠逡逑原蛋白束為較粗的成熟膠原蛋白，即Ｉ型膠原蛋白如圖１所示，病例組Ｉ型膠原蛋逡逑白含量為１６．６５±６．６３％，對照組Ｉ型膠原蛋白含量為２５．２７±５．５４％。兩組間的Ｉ型膠原蛋逡逑白含量具有顯著性差異，ＰＯＰ組Ｉ型膠原蛋白含量顯著低于非ＰＯＰ組，ＰＣ０．００１。非逡逑ＰＯＰ組Ｉ型膠原蛋白排列更加密集、有序，而ＰＯＰ組Ｉ型膠原蛋白排列疏松、紊亂。病逡逑例組ＩＩＩ型膠原蛋白含量為１３．２９±７．７９％，對照組ＩＩＩ型膠原蛋白含量為１２．９５±７．８７％。兩逡逑組間的ＩＩＩ型膠原蛋白含量無顯著性差異，，Ｐ＝０．８０２。病例組Ｉ／ＩＩＩ型膠原蛋白含量比值為逡逑２．３３±３．８８，對照組Ｉ／ＩＩＩ型膠原蛋白含量比值為３．２８±３．２１。兩組間的Ｉ／ＩＩＩ型膠原蛋白含逡逑量比值無顯著性差異

四．ａ－ＳＭＡ免疫組織化學染色法檢測病例組及對照組肌層的非血管平滑肌含量逡逑我們使用ｃｘ－ＳＭＡ免疫組織化學染色來檢測病例組及對照組陰道前壁肌層非血管平逡逑滑肌的形態(tài)及含量變化（圖２）。圖２Ａ顯示陰道壁的組織結(jié)構(gòu)，由上皮（ｅｐｉ）、固有層逡逑（ｌｐ）、肌層（ｓｍ）及外膜（ａｄ）構(gòu)成。較之于對組照（圖２Ｃ），病例組（圖２Ｂ）的肌逡逑層平滑肌束變細，排列紊亂。分析結(jié)果顯示，病例組肌層非血管平滑肌含量為逡逑２６．０４±４．３６％，對照組的肌層非血管平滑肌含量為４４．７４±５．６５％，病例組的肌層平滑肌含逡逑量顯著低于對照組，戶＜０．００１。逡逑Ａ逡逑ｅｐｉ逡逑ｙ逡逑ａｄ邋一抑？逡逑Ｂ邐？一－邐：Ｓｒ：：一；邋：邋＾逡逑ｂ１逡逑□邋榦逡逑ｃ邋、邐．＇ｉ＿邋震逡逑逢邋＇逡逑Ｄ邋ｉ６０］—：—逡逑卜ｎ邋■逡逑１Ｊ－Ｕ＿樐￣逡逑圖２．ＣＸ－ＳＭＡ免疫組織化學陰道前壁染色情況。Ａ為陰道壁組織結(jié)構(gòu)的示意圖（ｘ２０），邋ｅｐｉ：上皮，ｌｐ：逡逑固有層，ｓｍ：肌層，ａｄ：外膜；Ｂ圖為病例組（＞＜５０），右側(cè)ｂｌ顯示為局部放大圖像（ｘ２００）；邋Ｃ圖為逡逑對照組（Ｘ５０），右側(cè)ｃｌ顯示為局部放大圖像（ｘ２００）；邋Ｄ圖為兩組肌層非血管平滑肌含量對比的柱狀逡逑圖
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R711.2;R-332

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本文編號：2654260