本文關鍵詞：鼠傷寒沙門氏菌spv基因回補株的構建及其對腸粘膜上皮細胞凋亡的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:構建穩(wěn)定的沙門氏菌表達載體,在此基礎上構建鼠傷寒沙門氏菌spv基因回補株并研究其穩(wěn)定性。體外建立鼠傷寒沙門氏菌感染Henle-407的細胞模型,觀察沙門菌質粒毒力基因spvC對腸粘膜上皮細胞凋亡的影響及其分子機制。為探討鼠傷寒沙門菌質粒毒力基因spvC致病機制提供理論和實驗依據(jù),并為后續(xù)利用動物模型進行該基因功能的研究提供工具和手段。方法:一、鼠傷寒沙門氏菌spv基因熒光回補株的構建及其穩(wěn)定性的研究。以低拷貝克隆載體pACYC-184為基礎,根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的eGFP基因序列,上游增加Trc Promoter啟動子,下游增加rrnB ribosomal終止子,兩端位點上、下游序列設計相應酶切位點,采用多重PCR的方法合成pACYC184-eGFP載體,并依次調取及克隆aphA-hok-parDE基因和spv基因,構建得到pACYC184-eGFP-HOK載體、pACYC184-spvB-eGFP-HOK載體及pACYC184-spvC-eGFP-HOK載體,分別電轉化入對應的鼠傷寒沙門氏菌spv基因缺陷變異株得到相應的回補株,并對質粒的穩(wěn)定性及熒光蛋白表達情況進行檢測。二、沙門氏菌質粒毒力基因spvC對腸粘膜上皮細胞凋亡的影響及其分子機制的研究。攜帶spv基因(Salmonella plasmid virulence genes)的野生型鼠傷寒沙門氏菌211、敲除spvC的缺陷變異株(ST211-△-e-spvC)及回補株(ST211-c-spvC)與Henle-407細胞共培養(yǎng),取不同干預時間點的細胞進行實驗。熒光顯微鏡觀察細胞核形態(tài)學改變和胞內菌數(shù)量;Promega熒光素酶發(fā)光法檢測Caspase3/7活性;Western blot法檢測ERK和p-ERK表達水平;胞內集落形成單位的檢測采用平板菌落計法。結果:一、鼠傷寒沙門氏菌spv基因回補株的構建及其穩(wěn)定性的研究。1.經(jīng)PCR及基因測序證實成功構建鼠傷寒沙門菌spvB、spvC基因熒光回補株。2.含有低拷貝質粒的回補株在連續(xù)培養(yǎng)12代或144h都未發(fā)生丟失,在細菌感染細胞模型中用熒光顯微鏡可觀察到細菌帶綠色熒光。二、沙門氏菌質粒毒力基因spvC對腸粘膜上皮細胞凋亡的影響及其分子機制的研究。1.熒光顯微鏡下ST211感染組與ST211-c-spvC感染組細胞在4h出現(xiàn)大量的細胞核呈波紋狀或折縫樣、部分染色質凝聚等早期細胞凋亡形態(tài)學改變,而ST211-△-e-spvC感染組及空白對照組無明顯凋亡形態(tài)學改變。感染24h,ST211感染組與ST211-c-spvC感染組細胞的染色質高度凝聚邊緣化、產生凋亡小體并出現(xiàn)大量以壞死為特征的形態(tài)學改變,ST211-△-e-spvC僅部分細胞存在凋亡、壞死形態(tài)學改變。2.Caspase-3/7活性檢測結果顯示,各組Caspase-3/7活性隨感染時間的延長而升高,0h和4h,三個感染組間的Fluorescence值無明顯差異(P0.05);感染后4h,細菌感染組較空白對照組出現(xiàn)顯著差異(P0.01);感染的8h、12h和24h,ST211-△-e-spvC感染組較ST211-eGFP感染組和ST211-c-spvC感染組的Fluorescence值有差異(P0.05)。3.p-ERK蛋白的比值分別為(24h;空白對照組,0.89±0.03;ST211-eGFP感染組,0.12±0.02;ST211-△-e-spvC感染組,0.74±0.05;ST211-c-spvC感染組,0.11±0.04),ST211-eGFP感染組與ST211-c-spv C感染組的p-ERK蛋白的比值較ST211-△-e-spvC感染組顯著降低(P0.01)。4.共培養(yǎng)的前4h,組間胞內活菌數(shù)無明顯差異(P0.05)。在干預后8h、12h和24h,ST211-eGFP感染組與ST211-c-spvC感染組胞內活菌數(shù)高于ST211-△-e-spvC感染組(P0.05)。結論:1.高度穩(wěn)定且含有綠色熒光蛋白標簽的沙門氏菌表達載體及spv基因回補株構建成功,為深入研究鼠傷寒沙門菌毒力基因的功能奠定了基礎。2.沙門菌質粒毒力基因spvC可通過誘導細胞凋亡促進細菌在宿主細胞內的存活和增殖,進而加重細胞損傷,這一作用可能與其影響ERK的磷酸化水平有關。
【關鍵詞】：鼠傷寒沙門氏菌 spv hok/sok parDE 細胞凋亡 MAPK
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R378
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-11
• 第1章 前言11-14
• 第2章 鼠傷寒沙門菌spv基因熒光回補株的構建及其穩(wěn)定性研究14-40
• 2.1 材料14-17
• 2.1.1 菌株、質粒14-15
• 2.1.2 主要試劑及儀器15-16
• 2.1.3 主要培養(yǎng)基及試劑配制16-17
• 2.2 方法17-33
• 2.2.1 技術路線17-22
• 2.2.2 eGFP基因（含啟動子終止子）的合成及克隆22-26
• 2.2.3 HOK基因的調取及克隆26-28
• 2.2.4 spvB及spvC基因的調取及克隆28-32
• 2.2.5 電感受態(tài)細胞的制備及電轉化入沙門氏菌32-33
• 2.2.6 質粒穩(wěn)定性評價33
• 2.3 結果33-38
• 2.3.1 PCR合成eGFP基因（含啟動子終止子）33-34
• 2.3.2 eGFP基因（含啟動子終止子）的克隆及鑒定34-35
• 2.3.3 hok/sok-par ED（簡稱HOK）基因的調取35
• 2.3.4 hok/sok-par ED（簡稱HOK）基因的克隆35-36
• 2.3.5 spvB及spvC基因的調取36
• 2.3.6 spvB及spvC基因的克隆36-37
• 2.3.7 平板計數(shù)法測量質粒穩(wěn)定性結果37-38
• 2.4 討論38-40
• 第3章 沙門氏菌質粒毒力基因spvC對腸粘膜上皮細胞凋亡的影響及其分子機制的研究40-53
• 3.1 材料40-42
• 3.1.1 菌株40
• 3.1.2 細胞株40
• 3.1.3 主要試劑及儀器40-41
• 3.1.4 主要培養(yǎng)基及試劑配制41-42
• 3.2 方法42-46
• 3.2.1 細菌培養(yǎng)及定量42-43
• 3.2.2 細胞的分組及培養(yǎng)43
• 3.2.3 細胞感染模型的建立43-44
• 3.2.4 細胞爬片制備及DAPI染色44
• 3.2.5 Caspase-3/7 活性的檢測44
• 3.2.6 Western blot法檢測MAPK通路蛋白分子表達水平44-45
• 3.2.7 胞內菌計數(shù)45
• 3.2.8 統(tǒng)計學分析45-46
• 3.3 結果46-50
• 3.3.1 DAPI熒光染色觀察凋亡過程中細胞核形態(tài)學改變46-47
• 3.3.2 Promega熒光素酶發(fā)光法檢測Caspase3/7 活性47-48
• 3.3.3 Western blot法檢測MAPK通路蛋白分子表達水平48-49
• 3.3.4 胞內菌計數(shù)結果49-50
• 3.4 討論50-53
• 第4章 結論和展望53-54
• 4.1 結論53
• 4.2 展望53-54
• 致謝54-55
• 參考文獻55-57
• 攻讀學位期間的研究成果57-58
• 綜述58-66
• 參考文獻63-66

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