【摘要】：背景人源化小鼠是指具有人組織、細胞,或者表達人基因的小鼠模型,是研究人類疾病和生物學的重要工具。在免疫學領(lǐng)域,人源化小鼠模型主要指在免疫缺陷小鼠中重建功能性人免疫系統(tǒng)的小鼠模型。經(jīng)過近三十年的發(fā)展,人源化小鼠的構(gòu)建方法不斷改進,人免疫系統(tǒng)的組成和功能日臻完善,已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到生物醫(yī)學的研究中,如感染、自身免疫性疾病、移植免疫和腫瘤等。其中,通過聯(lián)合移植人胚胎胸腺組織和胚胎肝臟來源的CD34~+造血干/祖細胞所建立的免疫系統(tǒng)人源化小鼠,在領(lǐng)域內(nèi)具有重要的影響力。它不僅具有多譜系、高水平的人適應(yīng)性和天然免疫系統(tǒng)重建,如T細胞、B細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞等,而且人T細胞是在所移植的人胚胎胸腺組織中發(fā)育的,具有HLA限制性。此外,它的外周免疫器官如脾臟和淋巴結(jié)中具有人免疫細胞組成的結(jié)構(gòu),如脾臟中的白髓。然而,該人源化小鼠模型肝臟中人免疫系統(tǒng)發(fā)育水平仍然相對較低。肝臟細胞占肝臟所有細胞的70-80%。肝臟作為人體的重要器官,它具有代謝、解毒、分泌膽汁、蛋白質(zhì)合成、儲存糖原等功能,這些功能主要是通過肝臟細胞實現(xiàn)的。肝臟也是一個具有免疫耐受特性和防御性免疫反應(yīng)平衡的免疫器官,它具有豐富的免疫系統(tǒng)組成,包括枯否(Kupffer)細胞、NK細胞、NK-like T(NKT)細胞和樹突狀細胞(Dendritic cells,DCs)等。據(jù)報道,肝臟細胞在肝臟免疫耐受的誘導和維持中具有重要作用,例如,肝臟細胞移植能夠誘導同種異基因移植的免疫耐受;肝臟細胞也能通過上調(diào)表達Jagged1,與T細胞表面Nocth受體結(jié)合,誘導耐受性T細胞的產(chǎn)生。然而,肝臟細胞是否在肝臟特異的免疫系統(tǒng)發(fā)育和形成中發(fā)揮作用,目前并沒有明確的證據(jù)。肝-免疫人源化小鼠是指同時具有人肝臟細胞嵌合和人免疫系統(tǒng)重建的小鼠模型。它在研究肝炎病毒HBV和HCV的免疫反應(yīng)和肝臟免疫病理變化中具有重要應(yīng)用。然而,在該小鼠中,人肝臟細胞對人免疫系統(tǒng)的發(fā)育產(chǎn)生何種影響,仍需要深入的研究。免疫缺陷小鼠肝損傷的特性,對構(gòu)建肝-免疫人源化小鼠模型是十分重要的。uPA/SCID小鼠(SCID小鼠肝臟中轉(zhuǎn)基因過表達uPA)是具有肝損傷的免疫缺陷小鼠,能夠有效的重建人肝臟細胞。然而,uPA/SCID小鼠具有一些缺點:1,自發(fā)肝損傷,導致實驗窗口必須限制在出生3周以前;2,同源重組導致的轉(zhuǎn)基因丟失;3,繁育能力低。這嚴重限制了其廣泛應(yīng)用。因此,開發(fā)一種可以調(diào)控uPA功能的新策略,從而克服上述限制,在領(lǐng)域內(nèi)十分重要。目的在本課題中,我們首先優(yōu)化抗小鼠Fas抗體(Jo2)誘導免疫缺陷小鼠肝損傷的實驗方案,并評估人胚胎肝臟細胞重建的效果;然后建立肝-免疫人源化小鼠模型,研究人肝臟細胞對人免疫系統(tǒng)發(fā)育的影響;此外,我們將探討基于uPA的小鼠肝損傷新策略及其在理論上的可行性(即uPA-ERT2融合表達時,ERT2是否能夠調(diào)控uPA的功能);我們用NOD/SCID小鼠制備了肝臟特異表達uPA-ERT2的轉(zhuǎn)基因小鼠(NOD/SCID-uPA-ERT2)。方法我們首先建立基于抗小鼠Fas抗體(Jo2)處理的免疫缺陷小鼠肝損傷模型,通過移植人胚胎肝臟細胞,建立人胚胎肝臟細胞重建的小鼠。通過ELISA、免疫組化和qRCR的方法,評價人胚胎肝細胞重建和發(fā)育的情況。然后,我們在人胚胎肝細胞重建的基礎(chǔ)上,再對小鼠進行同源人胚胎胸腺組織和胚胎肝臟來源CD34~+細胞聯(lián)合移植,建立肝-免疫人源化小鼠。通過流式、免疫組化、多色免疫組化和qPCR方法研究人肝臟細胞對外周血、脾臟和肝臟中人免疫系統(tǒng)發(fā)育的影響,并且探索可能導致相應(yīng)影響的原因。通過體外人肝臟細胞和人免疫細胞共培養(yǎng)實驗,進一步驗證肝臟細胞對免疫細胞存活和擴增的影響。最后,我們設(shè)計了基于uPA的小鼠肝損傷新策略,即融合表達uPA-ERT2,并通過細胞遷移實驗和uPA酶活性實驗,驗證ERT2能否能通過它的配體4羥基他莫昔芬(4OH-T)調(diào)控uPA的功能。構(gòu)建基于Tol2轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的載體Mouse albumin promoter/enhancer-uPA-ERT2-pA,和轉(zhuǎn)座酶一起顯微注射到NOD/SCID小鼠的受精卵,制備NOD/SCID-uPA-ERT2小鼠。結(jié)果注射不同劑量的Jo2抗體(0,0.2,0.4,0.9mg/kg),導致NCG免疫缺陷小鼠血清中ALT的水平顯著不同,HE實驗顯示肝損傷的情況不同。Jo2導致的肝臟細胞死亡主要發(fā)生在血管周圍。我們發(fā)現(xiàn),不同劑量的Jo2抗體,能夠?qū)е滦∈蟠婊畹母怕什煌?分別注射0,0.3,0.4,0.5mg/kg Jo2抗體,48小時內(nèi)小鼠的存活率分別為100%,100%,67%,33%。間隔24小時連續(xù)注射兩次Jo2(0.3mg/kg),能夠產(chǎn)生持續(xù)的肝損傷。連續(xù)注射Jo2(0.3mg/kg/3天)10周,NCG小鼠是健康的。人胚胎肝臟細胞經(jīng)脾臟移植給NCG小鼠,在移植后24小時,可以觀察到人胚胎肝臟細胞從小鼠脾臟向肝臟的轉(zhuǎn)移。這些小鼠經(jīng)過0.3mg/kg/3天的Jo2抗體持續(xù)處理10周,外周血中具有持續(xù)的、逐漸升高的人白蛋白分泌。免疫組化檢測到小鼠肝臟組織中具有人肝臟細胞的重建。應(yīng)用qPCR比較重建人胚胎肝臟細胞的小鼠肝組織、人胚胎肝組織和成人肝組織中人肝臟細胞特異的代謝基因表達,如CYP1A2(Cytochrome P450 1A2)和CYP2D6(Cytochrome P450 2D6),Phase II酶UGT1A1(Bilirubin UDP-glucuronosyltransferase 1-1),和Transpotors MRP2(Multidrug resistance-associated protein 2)和NTCP(Na+/taurocholate Cotransporting),我們發(fā)現(xiàn)人胚胎肝臟細胞在小鼠肝臟中有向成人肝臟細胞方向發(fā)育的趨勢,但仍然不及成人肝臟細胞成熟。NCG小鼠中重建人胚胎肝臟細胞后,再經(jīng)過人胚胎胸腺組織和胚胎肝臟來源CD34~+細胞聯(lián)合移植,應(yīng)用Jo2進行小鼠肝損傷誘導來促進人肝臟細胞的重建,即可建立肝-免疫人源化小鼠模型。該小鼠的外周血中具有持續(xù)的人白蛋白分泌,肝臟中具有人肝臟細胞的重建。該肝-免疫人源化小鼠,相比于免疫系統(tǒng)人源化小鼠,外周血和脾臟中人免疫細胞水平?jīng)]有明顯的區(qū)別,脾臟中人免疫細胞亞群包括CD3~+CD4~+T、CD3~+CD4~+T、CD19~+B和CD14~+單核/巨噬細胞的比例也沒有明顯區(qū)別;而肝臟中的免疫細胞的水平,包括CD68~+巨噬細胞、CD11c~+樹突狀細胞和CD94~+NK細胞,卻有明顯的升高。進一步研究發(fā)現(xiàn),在肝-免疫人源化小鼠的肝臟中,人肝臟細胞富集的區(qū)域具有更多的人免疫細胞重建,這些人免疫細胞包括CD68~+單核/巨噬細胞、CD11c~+樹突狀細胞和CD94~+NK細胞。重建在小鼠肝臟中的人肝臟細胞能夠分泌一系列造血細胞因子,包括IL-3、GM-CSF、M-CSF和IL-15,以及免疫細胞趨化因子MCP-1、CXCL-1和CXCL-10。此外,體外共培養(yǎng)實驗證明,人肝臟細胞能夠促進人免疫細胞存活和擴增,這些細胞包括CD33~+細胞,NKp46~+細胞,和CD3~+細胞。4T1-uPA-2ERT2細胞系的遷移能力和4T1-GFP相似,都明顯低于4T1-uPA。當加入ERT2的配體4OH-T時,盡管它能抑制4T1細胞系的遷移,但是4T1-uPA-2ERT2的遷移能力變得和4T1-uPA一樣,即4OH-T處理后的4T1-uPA-ERT2提高了遷移能力。此外,4OH-T處理后,瞬轉(zhuǎn)的293FT-uPA-ERT2細胞的培養(yǎng)上清液和細胞裂解的蛋白中uPA的酶活性升高,并且是4OH-T劑量依賴的。這些結(jié)果證明,ERT2能夠通過4OH-T調(diào)控uPA的酶活性。此外,我們共得到20只F0代NOD/SCID-uPA-ERT2小鼠,隨機抽取的10只得到DNA測序的進一步驗證。RT-PCR實驗表明uPA-ERT2特異在NOD/SCID-uPA-ERT2小鼠的肝臟中表達。與NOD/SCID小鼠相比,NOD/SCID-uPA-ERT2小鼠有一定程度的肝損傷,這可能是由于uPA-ERT2存在一定程度的滲漏。NOD/SCID-uPA-ERT2小鼠分離的肝臟細胞在體外培養(yǎng)的過程中,經(jīng)過4OH-T處理后,培養(yǎng)上清液中uPA的酶活性升高。更重要的是,NOD/SCID-uPA-ERT2小鼠經(jīng)過他莫昔芬灌胃處理后,血清中uPA的酶活性和ALT水平明顯升高。結(jié)論人胚胎肝臟細胞能夠在基于Jo2的肝損傷NCG小鼠中有效的重建,它們具有肝向成熟肝臟細胞方向發(fā)育的趨勢;在肝-免疫人源化小鼠中,人肝臟細胞對外周血和脾臟中的人免疫系統(tǒng)發(fā)育沒有明顯的影響,而對肝臟中人免疫系統(tǒng)的發(fā)育具有顯著的促進作用;人免疫細胞和人肝臟細胞在位置上共定位,即肝-免疫人源化小鼠肝臟中重建人肝臟細胞的區(qū)域具有更多的人免疫細胞;重建的人肝臟細胞能夠分泌一系列造血細胞因子和免疫細胞趨化因子;在體外,人肝臟細胞能夠促進人免疫細胞的存活和擴增;通過體外實驗、離體實驗和體內(nèi)實驗,我們證明ERT2能夠通過它的配體4OH-T調(diào)控uPA的功能。NOD/SCID-uPA-ERT2小鼠通過他莫昔芬能夠能夠提高肝損傷。
【圖文】：

學家在以小鼠或大鼠為模型的研究中，得到了豐富的生物醫(yī)學的知于種屬差異的存在，很多從小鼠或大鼠研究中獲得的知識和人類生同[1]。例如，應(yīng)用免疫檢驗點阻斷療法抗 CTLA-4 可以有效激活荷瘤免疫反應(yīng)，完全清除腫瘤，而在腫瘤患者中產(chǎn)生的免疫反應(yīng)只是長，延長患者的生存期，并不能像在小鼠實驗中表現(xiàn)的那樣可以治國食品與藥品管理局（The US Food and Drug Administration (FDA中批準約只有 10%藥物，而其中 80%在臨床實驗中失敗了，其中原的前臨床實驗并不能模擬人類疾病反應(yīng)[3]。另外，動物和人類的生完全相同，比如在天然免疫系統(tǒng)方面，小鼠沒有 Toll 樣受體 10（or 10，TLR10），而人類沒有 TLR11，TLR12 和 TLR13[4]。人源化小用，彌補了當前動物模型在生物醫(yī)學研究的一些不足。人源化小鼠小鼠體內(nèi)移植了具有功能的人的細胞、組織，或者表達人的基因。的前臨床研究，以及在人類基礎(chǔ)生物學研究中，變得越來越重要。

藥物耐受等[101-103]。肝臟的免疫耐受特性主要由于這些特異的抗原提成細胞（內(nèi)皮細胞、枯否細胞、樹突狀細胞、星型細胞）介導的，他們能夠提成抗原給 T 細胞，進而誘導 T 細胞的凋亡、無反應(yīng)或誘導調(diào)節(jié)性 T 細胞的發(fā)育[102, 104]。然而，肝臟中的免疫系統(tǒng)也起到免疫防御的作用，如抵御微生物感染、清除死亡細胞和免疫監(jiān)視細胞癌變等[98]。肝臟中具有大量的天然淋巴細胞，如 NK 細胞、NKT 細胞、γ T 細胞和 MAITT(mucosal-associatedinvariantT)細胞等[98]。這些細胞能夠識別微生物的代謝產(chǎn)物、能夠?qū)D(zhuǎn)化的細胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)、能夠誘導其他免疫細胞的分化和發(fā)育。因此，這些細胞能夠克服肝臟的免疫耐受特性，對肝臟的免疫防御具有重要的作用[98, 99]。此外，肝臟中的免疫系統(tǒng)，對于肝臟損傷、肝臟纖維化和肝臟再生等也具有重要作用[105]。例如，肝臟中 NK 細胞的活化，如經(jīng)干擾素處理，能夠有效的殺傷星型細胞、病毒感染的肝臟細胞和腫瘤細胞，，進而能夠緩解肝臟纖維化[106]。因此，肝臟中的豐富的細胞組成對維持肝臟多種功能具有重要作用。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R392

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本文編號：2652757