【摘要】：第一部分:靶向樹(shù)突狀細(xì)胞的卵清蛋白納米疫苗誘導(dǎo)免疫耐受的研究特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis,AD)是一種慢性復(fù)發(fā)性炎癥性疾病,發(fā)病機(jī)制中針對(duì)過(guò)敏原的Th2型為主的免疫反應(yīng)起重要作用。傳統(tǒng)藥物治療均不能防止復(fù)發(fā)。過(guò)敏原特異性免疫治療(Allergen specific immunotherapy,AIT)是目前針對(duì)病因治療的唯一有效的辦法。聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)納米小球是疫苗載藥系統(tǒng)的研究熱點(diǎn),是綜合解決緩慢持續(xù)釋放、提高靶向性及生物利用度的良好方案。本研究制備了荷載過(guò)敏原卵清蛋白(OVA)的PLGA納米小球,并利用甘露聚糖(Mannan)修飾納米小球,通過(guò)靶向樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs),提高其攝取效率,進(jìn)而誘導(dǎo)T細(xì)胞的極化以達(dá)到過(guò)敏原特異性免疫治療的目的。首先,我們利用復(fù)乳劑-溶液揮發(fā)法制備荷載OVA的PLGA納米小球,采用吸附的方式將Mannan修飾在納米小球表面,掃描電鏡檢測(cè)制備的納米小球形狀圓潤(rùn)規(guī)整,Zeta電位及激光粒度分析儀檢測(cè)納米小球粒徑均在250nm-300nm之間,荷載了過(guò)敏原的納米小球表面Zeta電勢(shì)絕對(duì)值在20-30mv之間,粒徑分布較為均勻一致,BCA蛋白測(cè)定法測(cè)定OVA包封率為69.5%±4.1%,并可在體外緩慢持續(xù)釋放,CCK-8方法檢測(cè)PLGA納米小球細(xì)胞毒性較低。然后,將荷載OVA的PLGA-OVA納米小球和PLGA-OVA-Mannan小球與外周血誘導(dǎo)的DCs(MoDCs)共孵育24小時(shí),DCs表面CD80、CD86及CD83、HLA-DR的表達(dá)不同程度下降;細(xì)胞分泌促炎性細(xì)胞因子IL-6、TNF-α水平較陰性對(duì)照升高,但較游離OVA溶液刺激組顯著降低,IL-10水平較陰性對(duì)照及OVA溶液組水平顯著升高,實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示荷載OVA的PLGA納米小球可以降低DCs活化水平,誘導(dǎo)DCs向半成熟或未成熟方向發(fā)展。最后,將與納米小球刺激過(guò)的DCs與自體來(lái)源初始T細(xì)胞體外共培養(yǎng)6天,流式檢測(cè)T細(xì)胞的極化方向,結(jié)果顯示與OVA溶液刺激組相比,分泌IL-4的Th2細(xì)胞亞群比例明顯降低,分泌IL-22、IL-17、IFN-γ的Th22、Th17、Th1細(xì)胞亞群比例呈下降趨勢(shì),表達(dá)FoxP3的Treg細(xì)胞比例顯著升高,提示納米小球可抑制T細(xì)胞向Th2方向極化,誘導(dǎo)T細(xì)胞向Treg方向極化,參與誘導(dǎo)免疫耐受。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,荷載抗原的納米小球在體外可抑制DCs向成熟方向發(fā)展,進(jìn)而誘導(dǎo)T細(xì)胞向Treg方向分化,誘導(dǎo)免疫耐受,有望成為新型的靶向DCs的過(guò)敏原疫苗,期望對(duì)過(guò)敏原特異性免疫治療提供新思路。第二部分:特應(yīng)性皮炎患者皮膚、口腔、腸道菌群特征及相關(guān)性研究關(guān)于AD患者皮膚和腸道菌群特征曾經(jīng)有研究分別單獨(dú)描述過(guò);然而,從未有研究描述過(guò)AD患者口腔菌群特征,來(lái)自AD患者的不同部位菌群間的聯(lián)系也尚不清楚。本研究分析、比較了 AD患者皮膚、口腔、腸道三部位菌群的結(jié)構(gòu)及功能。選取172名AD患者及120名健康對(duì)照者,收集皮膚、口腔和腸道標(biāo)本,通過(guò)16sRNA基因擴(kuò)增子測(cè)序獲得三部位菌群信息,同時(shí)收集臨床信息。我們將測(cè)序結(jié)果匯總分析發(fā)現(xiàn)AD患者皮膚及口腔菌群多樣性有不同程度的下降,下降程度和疾病嚴(yán)重性呈正相關(guān),腸道菌群多樣性未見(jiàn)明顯下降。AD患者在不同部位的菌群結(jié)構(gòu)與對(duì)照相比都有差異,這種差異在不同部位之間互不相同,而且AD患者皮膚和口腔菌群距離比健康對(duì)照更近。AD患者不同部位菌群有著部位特異性的改變,在AD中許多口腔特異性菌種在皮膚和口腔的富集方向是相反的。而且,AD患者皮膚及口腔菌群功能通路呈負(fù)相關(guān)性。以上結(jié)果表明,AD患者皮膚、口腔及腸道三部位菌群結(jié)構(gòu)和功能有部位特異性的改變。AD患者口腔菌群和皮膚菌群有著密切聯(lián)系,可能對(duì)皮膚炎癥起調(diào)控作用。
【圖文】：

（２６７．３±１．１）邋ｎｍ，ＰＤＩ０．００６±０．００２逡逑１００－１邋，邐５「１００逡逑一邐８０邋－邐蠢，，邐ｉ逡逑Ｓ邐！逡逑吝邐６。－邐｜ｒ．逡逑ｉ邐Ｅ，邐ｉ邐－５0逡逑｜邐４０＇邐悘｜逡逑０］邐ＨＬ邐Ｌ逡逑２５０邐１０００逡逑Ｄｉａｍｅｔｅｒ（ｎｍ）逡逑圖１空白ＰＬＧＡＮＰ粒徑分布圖逡逑代表納米小球粒徑大��；縱坐標(biāo)左側(cè)Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ表示相應(yīng)粒徑的顆粒曲線(xiàn)。表示相應(yīng)粒徑的累積百分比。逡逑２邋ＰＬＧＡ－ＯＶＡ納米小球：Ｚｅｔａ電位及激光粒度分析儀測(cè)量結(jié)（２７２±１５．７）邋ｎｍ，邋ＰＤＩ為０．０１±０．００７逡逑１００，一邐；邋「１００逡逑

北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士論文．５統(tǒng)計(jì)學(xué)分析逡逑驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。計(jì)量資料獨(dú)立多組間均數(shù)差異比因素ＡＮＯＶＡ檢驗(yàn)方法。統(tǒng)計(jì)結(jié)果用Ｇｒａｐｈｐａｄ邋ｐｒｉｓｍ作圖。逡逑．實(shí)驗(yàn)結(jié)果逡逑．１邋ＰＬＧＡ納米小球粒徑大小測(cè)定逡逑．１．１空白ＰＬＧＡ納米小球：Ｚｅｔａ電位及激光粒度分析儀測(cè)量結(jié)為（２６７．３±１．１）邋ｎｍ，ＰＤＩ為０．００６±０．００２逡逑１００－１邋，邐５「１００逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2650826