【摘要】：結(jié)核病(Tuberculosis,TB)是當(dāng)前人類(lèi)面臨的最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生安全威脅之一,也是全球十大死因之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)2018年全球結(jié)核病報(bào)告數(shù)據(jù)顯示,全球新發(fā)結(jié)核病患者約1010萬(wàn),估算結(jié)核病死亡人數(shù)約為157萬(wàn)。結(jié)核病防控所面臨的挑戰(zhàn)主要包括以下兩個(gè)方面:一方面,結(jié)核病的耐藥形勢(shì)日趨嚴(yán)峻:據(jù)WHO估算,2017年全球新發(fā)耐多藥結(jié)核病(Multidrug resistant-tuberculosis,MDR-TB)約 46 萬(wàn)例。MDR-TB 治療難度大、治療周期長(zhǎng)、且治愈率低,急需研發(fā)新的抗結(jié)核藥物來(lái)應(yīng)對(duì)日益嚴(yán)重的結(jié)核病耐藥形勢(shì)。另一方面,結(jié)核潛伏感染(latent tuberculosis infection,LTBI)情況更是不容樂(lè)觀(guān)。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì),全球有四分之一的人口屬于LTBI人群,我國(guó)也有近3.6億人口處于LTBI,LTBI是活動(dòng)性肺結(jié)核的重要來(lái)源之一,急需建立阻止其發(fā)展成為活動(dòng)性肺結(jié)核的策略。毒素-抗毒素(Toxin-antitoxin,TA)系統(tǒng)廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌染色體或質(zhì)粒中,是由處于同一操縱子的雙順?lè)醋訕?gòu)成,其分別編碼發(fā)揮毒性作用的毒素以及具有解毒功能的抗毒素。越來(lái)越多的證據(jù)表明TA系統(tǒng)參與了細(xì)菌基因組穩(wěn)定性、生物膜形成、噬菌體抵抗、持留菌形成以及細(xì)菌毒力等。以TA系統(tǒng)為靶點(diǎn),以激活毒素的毒性為手段的抗生素研發(fā)策略已在多個(gè)致病菌中初見(jiàn)成效,并在結(jié)核分枝桿菌中表現(xiàn)出抑菌效果,已經(jīng)成為抗結(jié)核藥物研發(fā)的新策略。在結(jié)核分枝桿菌中含有至少79對(duì)TA系統(tǒng),其中11對(duì)TA系統(tǒng)未進(jìn)行生物學(xué)功能的驗(yàn)證。11 對(duì) TA 中有 3 對(duì)(Rv0836c-Rv0837c、Rv1045-Rv1044、Rv2827c-Rv2826c)預(yù)測(cè)屬于Ⅳ型TA。本研究選取其中一對(duì)TA系統(tǒng)Rv1045-Rv1044進(jìn)行系統(tǒng)的生物學(xué)功能研究。Rv1045-Rv1044以TA系統(tǒng)特征性的雙順?lè)醋有问椒植荚诮Y(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組中,并通過(guò)細(xì)菌毒性和中和試驗(yàn)明確Rv1045-Rv1044為典型的TA,即Rv1045毒蛋白的表達(dá)能夠抑制大腸桿菌的生長(zhǎng),而其相應(yīng)的抗毒蛋白R(shí)v1044表達(dá)能解除毒蛋白對(duì)大腸桿菌的抑制作用。體外免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)試驗(yàn)結(jié)果顯示 Rv1045 和 Rv1044 存在相互作用,與之前推測(cè)的Rv1045與Rv1044之間無(wú)相互作用而歸屬于Ⅳ型TA系統(tǒng)結(jié)論相悖。對(duì)Rv1045毒蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析,發(fā)現(xiàn)其編碼鳥(niǎo)苷酰轉(zhuǎn)移酶樣蛋白,包括了 N端結(jié)構(gòu)域(N-terminal domain,NTD)和 C 端結(jié)構(gòu)域(C-termina]domain,CTD),NTD(1-181 aa)呈現(xiàn)出核苷酸轉(zhuǎn)移酶樣蛋白特有的α/β折疊。長(zhǎng)α2螺旋被七個(gè)β-折疊(β1-β7)和五個(gè)α－螺旋(α1-α5)所環(huán)繞。CTD是由5個(gè)α螺旋組成的一個(gè)扭曲的螺旋束(α6-α10)。NTD和CTD之間形成了一個(gè)大的中央空洞,且富含正電荷,提示該空腔具有NTP結(jié)合口袋和核苷酸轉(zhuǎn)移酶(nucleotidyl transferase,NTase)活性位點(diǎn)的功能,NTP結(jié)合試驗(yàn)顯示Rv1045可以與GTP特異性結(jié)合,提示毒蛋白的毒性發(fā)揮可能依賴(lài)于轉(zhuǎn)移GMP到靶分子(蛋白或者核酸)從而引發(fā)毒性,其具體機(jī)制需深入研究。非常有趣的是,與單獨(dú)表達(dá)的Rｖ1045D82A結(jié)構(gòu)相比,與抗毒蛋白共表達(dá)的Rv1045結(jié)構(gòu)中,在S78位發(fā)生磷酸化修飾。為了進(jìn)一步確定S78磷酸化修飾為抗毒蛋白R(shí)v1044所為,我們又分別解析了Ｒv1045S78A、Rv1045D82A和Rv1045E146Q的單獨(dú)表達(dá)的晶體結(jié)構(gòu)以及和Rv1044共表達(dá)后的晶體結(jié)構(gòu)。通過(guò)7個(gè)晶體結(jié)構(gòu)的分析比對(duì),我們從晶體學(xué)上確定了 S78磷酸化與Rv1044表達(dá)有關(guān)。隨后,我們對(duì)單獨(dú)表達(dá)和與Rv1044共表達(dá)的Rv1045及其突變體蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,進(jìn)一步證實(shí)了 Rv1044參與了 Rv1045晶體結(jié)構(gòu)的S78磷酸化修飾。最后,通過(guò)體外激酶實(shí)驗(yàn)證明Rv1044直接參與了 Rv1045S78磷酸化,并通過(guò)毒性和中和實(shí)驗(yàn)證明Rv1045S78的磷酸化直接導(dǎo)致了其毒性喪失。綜上所述,我們通過(guò)對(duì)結(jié)核分枝桿菌中一對(duì)TA系統(tǒng)Rv1045-Rv1044研究表明,Rv1045-Rv1044為一對(duì)典型的TA系統(tǒng),Rv1045編碼鳥(niǎo)苷酰轉(zhuǎn)移酶樣蛋白,其通過(guò)轉(zhuǎn)移GMP到靶分子發(fā)揮毒性作用。而抗毒蛋白R(shí)v1044為一種非典型性激酶,其通過(guò)一種翻譯后修飾—磷酸化的方式發(fā)揮解毒功能,該解毒方式在TA系統(tǒng)中從未報(bào)道過(guò)。鑒于抗毒蛋白R(shí)v1044與毒蛋白R(shí)v1045之間存在直接的相關(guān)作用,Rv1045-Rv1044之間的解毒機(jī)制為激酶和底物的關(guān)系。因此,Rv1045-Rv1044為一種全新型的TA系統(tǒng)—Ⅶ型TA。其中,Rv1045為Ⅶ型鳥(niǎo)苷酰轉(zhuǎn)移酶樣蛋白(Type Ⅶ guanylyltransferase-like toxin,TglT),Rv1044 為 Ⅶ 型非典型激酶(Type Ⅶ atypical kinase antitoxin,TakA)。我們的研究結(jié)果不僅豐富了 TA系統(tǒng)的研究?jī)?nèi)容,并為以Rv1045-Rv1044為靶點(diǎn)的藥物設(shè)計(jì)提供依據(jù)。
【圖文】：

的直接相互作用。我們?cè)冢裕纾欤缘模枚嗽O(shè)計(jì)了一個(gè)ＦＬＡＧ－ｔａｇ邋（ＴｇｌＴ－ＦＬＡＧ），在逡逑ＴａｋＡ邋的邋Ｃ邋端設(shè)計(jì)了一個(gè)邋Ｍｙｃ－ｔａｇ邋（ＴａｋＡ－Ｍｙｃ）ＪｇｌＴ－ＦＬＡＧ邋和邋ＴａｋＡ－Ｍｙｃ邋在邋ＢＬ２］逡逑細(xì)胞中共表達(dá)，Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ檢測(cè)兩種蛋白的表達(dá)情況（圖２）。在Ｃｏ－ＩＰ實(shí)驗(yàn)中，逡逑當(dāng)我們用抗Ｆｌａｇ磁珠拉下ＴｇｌＴ－ＦＬＡＧ蛋白作為誘館時(shí)，我們觀(guān)察到了邋ＴａｋＡ－Ｍｙｃ逡逑的存在。然而，我們發(fā)現(xiàn)ＴａｋＡ－Ｍｙｃ與抗Ｆｌａｇ磁珠的結(jié)合并不特異，因?yàn)樵跊](méi)逡逑有ＴｇｌＴ－ＦＬＡＧ的情況下，ＴａｋＡ－Ｍｙｃ也可以被拉下。因此，我們選擇抗Ｍｙｃ磁逡逑珠進(jìn)行Ｃｏ－ＩＰ試驗(yàn)�？梗停阒樽优cＴｇｌＴ－ＦＬＡＧ無(wú)特異性結(jié)合（圖２）。當(dāng)我們用抗逡逑Ｍｙｃ珠子拉下ＴａｋＡ－Ｍｙｃ作為誘餌時(shí)，我們觀(guān)察到ＴｇｌＴ－ＦＬＡＧ的存在。Ｃｏ－ＩＰ實(shí)逡逑驗(yàn)表明ＴｇｌＴ與ＴａｋＡ有直接相互作用。因此，，確定其不屬于ＩＶ型ＴＡ系統(tǒng)定義逡逑的范疇。逡逑Ｔｇ�。裕疲欤撸粒清澹姡姡姡义希裕幔耄粒停沐澹姟鲞姡姡义希ⅲ鬟�0邋；義；ａ逡逑邐邐她令

本文編號(hào)：2643370