發(fā)布時間：2020-04-28 10:45

【摘要】：結核病(Tuberculosis,TB)是當前人類面臨的最嚴重的公共衛(wèi)生安全威脅之一,也是全球十大死因之一。據世界衛(wèi)生組織(WHO)2018年全球結核病報告數(shù)據顯示,全球新發(fā)結核病患者約1010萬,估算結核病死亡人數(shù)約為157萬。結核病防控所面臨的挑戰(zhàn)主要包括以下兩個方面:一方面,結核病的耐藥形勢日趨嚴峻:據WHO估算,2017年全球新發(fā)耐多藥結核病(Multidrug resistant-tuberculosis,MDR-TB)約 46 萬例。MDR-TB 治療難度大、治療周期長、且治愈率低,急需研發(fā)新的抗結核藥物來應對日益嚴重的結核病耐藥形勢。另一方面,結核潛伏感染(latent tuberculosis infection,LTBI)情況更是不容樂觀。據WHO統(tǒng)計,全球有四分之一的人口屬于LTBI人群,我國也有近3.6億人口處于LTBI,LTBI是活動性肺結核的重要來源之一,急需建立阻止其發(fā)展成為活動性肺結核的策略。毒素-抗毒素(Toxin-antitoxin,TA)系統(tǒng)廣泛存在于細菌和古細菌染色體或質粒中,是由處于同一操縱子的雙順反子構成,其分別編碼發(fā)揮毒性作用的毒素以及具有解毒功能的抗毒素。越來越多的證據表明TA系統(tǒng)參與了細菌基因組穩(wěn)定性、生物膜形成、噬菌體抵抗、持留菌形成以及細菌毒力等。以TA系統(tǒng)為靶點,以激活毒素的毒性為手段的抗生素研發(fā)策略已在多個致病菌中初見成效,并在結核分枝桿菌中表現(xiàn)出抑菌效果,已經成為抗結核藥物研發(fā)的新策略。在結核分枝桿菌中含有至少79對TA系統(tǒng),其中11對TA系統(tǒng)未進行生物學功能的驗證。11 對 TA 中有 3 對(Rv0836c-Rv0837c、Rv1045-Rv1044、Rv2827c-Rv2826c)預測屬于Ⅳ型TA。本研究選取其中一對TA系統(tǒng)Rv1045-Rv1044進行系統(tǒng)的生物學功能研究。Rv1045-Rv1044以TA系統(tǒng)特征性的雙順反子形式分布在結核分枝桿菌H37Rv基因組中,并通過細菌毒性和中和試驗明確Rv1045-Rv1044為典型的TA,即Rv1045毒蛋白的表達能夠抑制大腸桿菌的生長,而其相應的抗毒蛋白Rv1044表達能解除毒蛋白對大腸桿菌的抑制作用。體外免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)試驗結果顯示 Rv1045 和 Rv1044 存在相互作用,與之前推測的Rv1045與Rv1044之間無相互作用而歸屬于Ⅳ型TA系統(tǒng)結論相悖。對Rv1045毒蛋白進行結構解析,發(fā)現(xiàn)其編碼鳥苷酰轉移酶樣蛋白,包括了 N端結構域(N-terminal domain,NTD)和 C 端結構域(C-termina]domain,CTD),NTD(1-181 aa)呈現(xiàn)出核苷酸轉移酶樣蛋白特有的α/β折疊。長α2螺旋被七個β-折疊(β1-β7)和五個α－螺旋(α1-α5)所環(huán)繞。CTD是由5個α螺旋組成的一個扭曲的螺旋束(α6-α10)。NTD和CTD之間形成了一個大的中央空洞,且富含正電荷,提示該空腔具有NTP結合口袋和核苷酸轉移酶(nucleotidyl transferase,NTase)活性位點的功能,NTP結合試驗顯示Rv1045可以與GTP特異性結合,提示毒蛋白的毒性發(fā)揮可能依賴于轉移GMP到靶分子(蛋白或者核酸)從而引發(fā)毒性,其具體機制需深入研究。非常有趣的是,與單獨表達的Rｖ1045D82A結構相比,與抗毒蛋白共表達的Rv1045結構中,在S78位發(fā)生磷酸化修飾。為了進一步確定S78磷酸化修飾為抗毒蛋白Rv1044所為,我們又分別解析了Ｒv1045S78A、Rv1045D82A和Rv1045E146Q的單獨表達的晶體結構以及和Rv1044共表達后的晶體結構。通過7個晶體結構的分析比對,我們從晶體學上確定了 S78磷酸化與Rv1044表達有關。隨后,我們對單獨表達和與Rv1044共表達的Rv1045及其突變體蛋白進行質譜鑒定,進一步證實了 Rv1044參與了 Rv1045晶體結構的S78磷酸化修飾。最后,通過體外激酶實驗證明Rv1044直接參與了 Rv1045S78磷酸化,并通過毒性和中和實驗證明Rv1045S78的磷酸化直接導致了其毒性喪失。綜上所述,我們通過對結核分枝桿菌中一對TA系統(tǒng)Rv1045-Rv1044研究表明,Rv1045-Rv1044為一對典型的TA系統(tǒng),Rv1045編碼鳥苷酰轉移酶樣蛋白,其通過轉移GMP到靶分子發(fā)揮毒性作用。而抗毒蛋白Rv1044為一種非典型性激酶,其通過一種翻譯后修飾—磷酸化的方式發(fā)揮解毒功能,該解毒方式在TA系統(tǒng)中從未報道過。鑒于抗毒蛋白Rv1044與毒蛋白Rv1045之間存在直接的相關作用,Rv1045-Rv1044之間的解毒機制為激酶和底物的關系。因此,Rv1045-Rv1044為一種全新型的TA系統(tǒng)—Ⅶ型TA。其中,Rv1045為Ⅶ型鳥苷酰轉移酶樣蛋白(Type Ⅶ guanylyltransferase-like toxin,TglT),Rv1044 為 Ⅶ 型非典型激酶(Type Ⅶ atypical kinase antitoxin,TakA)。我們的研究結果不僅豐富了 TA系統(tǒng)的研究內容,并為以Rv1045-Rv1044為靶點的藥物設計提供依據。
【圖文】：

的直接相互作用。我們在ＴｇｌＴ的Ｃ端設計了一個ＦＬＡＧ－ｔａｇ邋（ＴｇｌＴ－ＦＬＡＧ），在逡逑ＴａｋＡ邋的邋Ｃ邋端設計了一個邋Ｍｙｃ－ｔａｇ邋（ＴａｋＡ－Ｍｙｃ）ＪｇｌＴ－ＦＬＡＧ邋和邋ＴａｋＡ－Ｍｙｃ邋在邋ＢＬ２］逡逑細胞中共表達，Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ檢測兩種蛋白的表達情況（圖２）。在Ｃｏ－ＩＰ實驗中，逡逑當我們用抗Ｆｌａｇ磁珠拉下ＴｇｌＴ－ＦＬＡＧ蛋白作為誘館時，我們觀察到了邋ＴａｋＡ－Ｍｙｃ逡逑的存在。然而，我們發(fā)現(xiàn)ＴａｋＡ－Ｍｙｃ與抗Ｆｌａｇ磁珠的結合并不特異，因為在沒逡逑有ＴｇｌＴ－ＦＬＡＧ的情況下，ＴａｋＡ－Ｍｙｃ也可以被拉下。因此，我們選擇抗Ｍｙｃ磁逡逑珠進行Ｃｏ－ＩＰ試驗�？梗停阒樽优cＴｇｌＴ－ＦＬＡＧ無特異性結合（圖２）。當我們用抗逡逑Ｍｙｃ珠子拉下ＴａｋＡ－Ｍｙｃ作為誘餌時，我們觀察到ＴｇｌＴ－ＦＬＡＧ的存在。Ｃｏ－ＩＰ實逡逑驗表明ＴｇｌＴ與ＴａｋＡ有直接相互作用。因此，，確定其不屬于ＩＶ型ＴＡ系統(tǒng)定義逡逑的范疇。逡逑Ｔｇ！Ｔ－Ｆｌ＿ＡＧ邋－邐＋邐－邐＋逡逑ＴａｋＡ－Ｍｙｃ邋－邐■邐＋邐＋逡逑＂，ｗ邐0邋；義；ａ逡逑邐邐她令

本文編號：2643370