【摘要】：在胚胎發(fā)育過(guò)程中,心臟是最早形成的結(jié)構(gòu)之一。闡明心臟發(fā)生過(guò)程中心肌細(xì)胞分化的基因調(diào)控機(jī)制對(duì)治療心臟疾病有重要的理論指導(dǎo)意義。ASB11屬于ASB家族(全名為含錨蛋白重復(fù)序列和細(xì)胞因子信號(hào)抑制物盒蛋白質(zhì)家族)。該家族的N端含有錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)序列,C端具有SOCS盒結(jié)構(gòu)。小鼠asb11基因(m-asb11,Gene ID:NC_000086.7)定位于X染色體上,由9個(gè)外顯子構(gòu)成。m-asb11基因的cDNA全長(zhǎng)1462 bp,編碼323個(gè)氨基酸。m-asb11在成體心臟以及成體生殖脂肪墊中大量表達(dá),參與生物體的生長(zhǎng)發(fā)育以及新陳代謝等多種生命過(guò)程。但目前對(duì)m-asb11在心臟發(fā)育中的作用尚無(wú)研究報(bào)道。因此,本論文利用P19細(xì)胞研究m-asb11基因?qū)19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的影響。P19細(xì)胞是從C3H/He小鼠畸胎瘤中分離建立起來(lái)的一種胚胎瘤細(xì)胞。P19細(xì)胞作為一種多能干細(xì)胞,具有干細(xì)胞分化潛能,也能快速增殖。P19細(xì)胞可以在含有0.5%-1.0%濃度的DMSO的培養(yǎng)環(huán)境下分化形成心肌細(xì)胞,同時(shí)在合適濃度的維甲酸的存在下誘導(dǎo)形成神經(jīng)和神經(jīng)膠質(zhì)樣細(xì)胞。但在DMSO和維甲酸的共同存在下,只會(huì)分化成神經(jīng)和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。本文首先用小鼠心臟組織提取了總RNA,利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,建立了小鼠cDNA文庫(kù)。以cDNA為模版利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出長(zhǎng)度為1042 bp的m-asb11基因。進(jìn)一步將擴(kuò)增的m-asb11基因片段連接到T-載體上,經(jīng)Bam HI和XhoI酶切消化,瓊脂糖分離獲得純化的m-asb11基因片段,連接到pCMV-Tag2B載體上,構(gòu)建成m-asb11基因表達(dá)質(zhì)粒。同時(shí),用1.0%DMSO誘導(dǎo)P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化,通過(guò)RT-PCR、免疫印跡以及細(xì)胞免疫熒光對(duì)誘導(dǎo)結(jié)果進(jìn)行了檢測(cè)。RT-PCR結(jié)果顯示nkx2.5在誘導(dǎo)組有RNA表達(dá)。免疫印跡結(jié)果顯示誘導(dǎo)細(xì)胞的心肌特異蛋白肌鈣蛋白T(CTNT)以及GATA4蛋白呈從無(wú)到有的表達(dá)模式。肌球蛋白重鏈蛋白MF20抗體免疫熒光顯示誘導(dǎo)組細(xì)胞表達(dá)肌球蛋白重鏈蛋白。這些結(jié)果說(shuō)明模型建立成功。本文進(jìn)一步利用該心肌細(xì)胞分化模型研究m-asb11基因?qū)19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化過(guò)程的影響。在P19細(xì)胞懸浮培養(yǎng)前轉(zhuǎn)染m-asb11基因表達(dá)質(zhì)粒,懸浮誘導(dǎo)4 d后,將誘導(dǎo)后細(xì)胞貼壁培養(yǎng),分別收集培養(yǎng)8 d和13 d的細(xì)胞提取總蛋白,采用免疫印跡技術(shù)(western blot)進(jìn)行GATA4和CTNT的蛋白表達(dá)分析。免疫印跡分析結(jié)果顯示,m-asb11過(guò)表達(dá)組中GATA4和CTNT的表達(dá)顯著低于誘導(dǎo)組,提示m-asb11可能抑制P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化過(guò)程。同時(shí),在培養(yǎng)7 d時(shí)取少量細(xì)胞爬片貼壁后進(jìn)行MF20抗體的免疫熒光。免疫熒光結(jié)果表明,相較于對(duì)照組,m-asb11過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞的熒光有所降低。該結(jié)果支持m-asb11可能抑制P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化過(guò)程的結(jié)論。
【圖文】：

碩士學(xué)位論文非常的保守；而泛素結(jié)合酶 E2 一般是分子量較小的蛋白，其活性主要-16 kDa 的核心區(qū)域的半胱氨酸殘基來(lái)維持[5]，泛素結(jié)合酶的主要功能是接到泛素連接酶 E3 上去；泛素連接酶 E3 的主要功能是識(shí)別底物蛋白接酶 E3 在細(xì)胞內(nèi)有很多種，它通過(guò)識(shí)別底物蛋白的特異性 motif 來(lái)使 E2 并且與底物蛋白結(jié)合，它的特異識(shí)別底物蛋白的能力賦予了它的選；泛素連接酶在選擇底物蛋白時(shí)，會(huì)借助輔助蛋白來(lái)與底物相結(jié)合[6]。

圖 1-2：P19 細(xì)胞誘導(dǎo)心肌分化過(guò)程中的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（引自參考文獻(xiàn)[61]）.7 本文研究意義心肌分化的研究在當(dāng)前的情形下是一個(gè)頗具前景的領(lǐng)域,很多心臟疾病都是于心肌細(xì)胞形成和分化過(guò)程中基因表達(dá)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)紊亂造成的[36]。心肌損傷大分都是由于正常的心肌細(xì)胞數(shù)量減少的原因，但是由于心肌在出生后就會(huì)失去殖能力，所以，壞死的心肌會(huì)由成纖維細(xì)胞形成的疤痕所取代。增加健康的，常收縮的心肌細(xì)胞的數(shù)量，是心肌損傷的一種有效的治療方式。心肌細(xì)胞移植以有效的增加心肌細(xì)胞，所以研究心肌細(xì)胞分化和形成過(guò)程的基因調(diào)控和鈣離的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程是很有必要的。關(guān)于 asb11 在神經(jīng)分化以及骨骼肌分化過(guò)程中的作用已有研究[31, 33, 34]。由于SB11 蛋白是在哺乳動(dòng)物心肌細(xì)胞中高表達(dá)的蛋白，其是否與心肌分化過(guò)程有
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R329.2

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本文編號(hào)：2643214