【摘要】：目的:利用干擾素誘導(dǎo)型MX-Cre在Ⅰ型干擾素反應(yīng)細(xì)胞中特異敲除含有7個(gè)WD40 repeat的接頭蛋白R(shí)ACK1(基因名Gnb2l1),分析這種小鼠模型對(duì)病毒的抗感染能力如何。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)并分析在Ⅰ型干擾素反應(yīng)細(xì)胞中特異敲除RACK1對(duì)造血干細(xì)胞、各譜系造血祖細(xì)胞的影響,分析RACK1缺失對(duì)造血干細(xì)胞的凋亡及增殖的影響。通過(guò)蛋白-蛋白相互作用分析探討RACK1調(diào)控造血干細(xì)胞的分子機(jī)制。方法:1.在Ⅰ型干擾素反應(yīng)細(xì)胞中敲除RACK1的小鼠模型,用Gnb2l1~(F/F,MX-Cre)表示,對(duì)照小鼠用Gnb2l1~(F/F)表示,課題組前期工作已經(jīng)建立相應(yīng)模型。在正式實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,剪鼠尾鑒定基因型,以區(qū)分Gnb2l1~(F/F,MX-Cre)小鼠和Gnb2l1~(F/F)小鼠。Gnb2l1~(F/F,MX-Cre)小鼠和Gnb2l1~(F/F)小鼠腹腔注射Poly(I:C),以實(shí)現(xiàn)Gnb2l1~(F/F,MX-Cre)小鼠的體內(nèi)誘導(dǎo)敲除。并通過(guò)WB鑒定在蛋白水平上是否敲除。2.腹腔注射Poly(I:C)后,Gnb2l1~(F/F,MX-Cre)小鼠和Gnb2l1~(F/F)小鼠尾靜脈注射VSV,后取小鼠外周血以得到血清,檢測(cè)血清中的IFNβ。取肺和肝并稱(chēng)重,分別計(jì)算肺/體重和肝/體重。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Gnb2l1~(F/F,MX-Cre)小鼠和Gnb2l1~(F/F)小鼠脾和肝中I型干擾素主要產(chǎn)生細(xì)胞pDC和髓系細(xì)胞的表達(dá)情況。3.取小鼠股骨骨髓,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分選造血干細(xì)胞、巨核細(xì)胞/紅細(xì)胞系祖細(xì)胞、粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞、髓系細(xì)胞祖細(xì)胞、淋巴細(xì)胞系祖細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞、髓系細(xì)胞、紅系細(xì)胞,通過(guò)Real-Time PCR檢測(cè)各個(gè)階段RACK1、c-Myc及N-Myc的基因表達(dá)水平,并通過(guò)多色熒光組化分析RACK1與造血干細(xì)胞的表面標(biāo)記CD117是否為共定位關(guān)系。Gnb2l1~(F/F,MX-Cre)小鼠及Gnb2l1~(F/F)小鼠股骨石蠟切片進(jìn)行HE染色分析骨髓的病理?yè)p傷情況。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析Gnb2l1~(F/F,MX-Cre)小鼠和Gnb2l1~(F/F)小鼠的造血干細(xì)胞、各譜系造血祖細(xì)胞比例和絕對(duì)數(shù),RACK1缺失對(duì)造血干細(xì)胞的凋亡及增殖的影響。制備嵌合體小鼠驗(yàn)證上述變化是否由于細(xì)胞的內(nèi)在缺陷所引起。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Gnb2l1~(F/F,MX-Cre)小鼠和Gnb2l1~(F/F)小鼠造血干細(xì)胞中c-Myc和N-Myc的表達(dá)量,并給小鼠腹腔注射Myc inhibitor進(jìn)行逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)。為接下來(lái)的機(jī)制探討提供基礎(chǔ)。4.基于上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn),免疫共沉淀(CO-IP)分析c-Myc、N-Myc分別與RACK1是否有相互作用。使用純化的GST及GST-RACK1直接pull down,分析是否為兩者的直接相互作用。純化Gnb2l1~(F/F,MX-Cre)小鼠及Gnb2l1~(F/F)小鼠造血干細(xì)胞,沉淀c-Myc或N-Myc,來(lái)分析E3泛素連接酶Fbxw7在其中產(chǎn)生的作用。結(jié)果:1.小鼠基因型鑒定成功。Gnb2l1~(F/F,MX-Cre)小鼠在Poly(I:C)誘導(dǎo)后蛋白水平上也實(shí)現(xiàn)敲除。2.VSV感染后,與Gnb2l1~(F/F)小鼠相比,Gnb2l1~(F/F,MX-Cre)小鼠血清中的IFNβ水平降低,肝肺濕重/體重比值有增高趨勢(shì)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示Gnb2l1~(F/F,MX-Cre)小鼠肝脾中Ⅰ型干擾素主要產(chǎn)生細(xì)胞pDC明顯少于Gnb2l1~(F/F)小鼠,并且髓系細(xì)胞也明顯低于Gnb2l1~(F/F)小鼠。3.Real-Time PCR結(jié)果顯示,在mRNA轉(zhuǎn)錄水平上,造血干細(xì)胞、各譜系造血祖細(xì)胞及成熟階段細(xì)胞都含有RACK1、c-Myc和N-Myc。從數(shù)據(jù)上來(lái)看,幼稚階段表達(dá)水平明顯高于成熟階段。通過(guò)Gnb2l1~(F/F)小鼠股骨石蠟切片進(jìn)行多色熒光組化的結(jié)果顯示RACK1與CD117具有熒光共定位。將Gnb2l1~(F/F)小鼠及Gnb2l1~(F/F,MX-Cre)小鼠股骨石蠟切片進(jìn)行HE染色分析,在Ⅰ型干擾素反應(yīng)細(xì)胞中特異敲除RACK1使骨髓腔內(nèi)造血細(xì)胞稀少。Gnb2l1~(F/F,MX-Cre)小鼠中造血干細(xì)胞、CMP和CLP在細(xì)胞比例上和細(xì)胞總數(shù)上都顯著減少,GMP及MEP在絕對(duì)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果中有明顯降低。HSC的凋亡及增殖在比例上都顯著增多。嵌合體小鼠實(shí)驗(yàn)證明以上變化是由于小鼠細(xì)胞內(nèi)在缺陷所引起。Ⅰ型干擾素反應(yīng)細(xì)胞中特異敲除RACK1會(huì)使HSC中表達(dá)c-Myc和N-Myc的細(xì)胞比例增多。注射Myc inhibitor可以部分逆轉(zhuǎn)HSC。4.CO-IP結(jié)果顯示,RACK1與c-Myc、N-Myc之間都有相互作用,并且證明為直接相互作用。純化的小鼠造血干細(xì)胞沉淀c-Myc或N-Myc,結(jié)果顯示在Ⅰ型干擾素反應(yīng)細(xì)胞中特異敲除RACK1后,c-Myc或N-Myc與E3泛素連接酶Fbxw7的相互作用減弱。結(jié)論:1.小鼠模型鑒定成功,區(qū)分出Gnb2l1~(F/F,MX-Cre)小鼠和Gnb2l1~(F/F)小鼠;2.在Ⅰ型干擾素反應(yīng)細(xì)胞中特異敲除RACK1使小鼠的抗感染能力減弱;3.在Ⅰ型干擾素反應(yīng)細(xì)胞中特異敲除RACK1使骨髓中的HSC和各譜系造血祖細(xì)胞大幅度減少。Gnb2l1~(F/F,MX-Cre)小鼠的HSC凋亡比例顯著增加,增殖也大幅增加。制備嵌合體小鼠證實(shí)了這種現(xiàn)象為細(xì)胞內(nèi)在缺陷所引起。逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)提示我們?cè)冖裥透蓴_素反應(yīng)細(xì)胞中特異敲除RACK1使骨髓中HSC產(chǎn)生一系列影響是由于c-Myc和N-Myc大量積聚所致;4.RACK1與c-Myc和N-Myc都具有直接相互作用,沉淀c-Myc或N-Myc,在Ⅰ型干擾素反應(yīng)細(xì)胞中特異敲除RACK1后,與c-Myc或N-Myc相互作用的Fbxw7蛋白量減少。c-Myc或N-Myc與Fbxw7相互結(jié)合作用減弱,導(dǎo)致c-Myc或N-Myc大量積聚。為以后深入研究RACK1影響HSC的機(jī)制提供有利參考。
【圖文】：

細(xì)胞分化產(chǎn)生紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和血小板[2]（圖1）。圖 1 造血干細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程Fig 1 Development of hematopoietic stem cells7

[18-20]。生理情況下構(gòu)成維持HSC的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，，調(diào)控HSC的分化、擴(kuò)增、運(yùn)動(dòng)及凋亡（圖2）[21]。在眾多類(lèi)型的成體干細(xì)胞中，造血干細(xì)胞是研究歷史最長(zhǎng)、認(rèn)識(shí)最為深入、也是最早應(yīng)用于臨床而且被公認(rèn)有臨床治療效果的一類(lèi)干細(xì)胞。8
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R329.2

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本文編號(hào)：2640646