【摘要】：背景:自1990年英國(guó)學(xué)者提出“成人疾病的胎兒起源”學(xué)說(shuō)后,母體甲狀腺機(jī)能減退對(duì)子代成年后退行性疾病和代謝性疾病的影響受到越來(lái)越多的關(guān)注。母體甲狀腺來(lái)源的甲狀腺激素對(duì)子代生長(zhǎng)發(fā)育和代謝發(fā)揮重要的作用,母體甲減可導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩,影響神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚、肺臟和骨骼系統(tǒng)的發(fā)育。而孕期甲狀腺機(jī)能減退對(duì)子代糖代謝的影響也得到了證實(shí),但是其具體機(jī)制尚不明確。甲狀腺激素受體(Thyroid hormone receptor,THR)是甲狀腺激素發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的重要途徑,目前已知活性甲狀腺激素可通過(guò)甲狀腺激素受體β(Thyroid hormone receptor β,TRβ)對(duì)胰島素分泌及β細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響,但宮內(nèi)甲狀腺激素缺乏是否通過(guò)TRβ受體途徑對(duì)子代胰島細(xì)胞功能產(chǎn)生影響尚無(wú)研究報(bào)道。目的:本研究以抗甲狀腺藥物丙硫氧嘧啶(PTU)誘導(dǎo)甲狀腺機(jī)能減退大鼠模型,觀察產(chǎn)后及仔鼠各觀察階段甲狀腺激素水平,評(píng)估母體甲狀腺機(jī)能減退對(duì)子代胰島發(fā)育的影響及血糖代謝的作用,觀察母鼠甲減對(duì)胰腺增殖功能和胰島素分泌能力的影響,并觀察胰腺TRβ表達(dá)的變化。通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察甲狀腺激素對(duì)胰島β細(xì)胞增殖、胰島素分泌功能影響,并探討TRβ對(duì)甲狀腺激素的調(diào)控作用。從而為青年起病的糖尿病的預(yù)防治療及新藥研發(fā)提供科學(xué)理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分:將生長(zhǎng)至180-220 g的雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠分為母鼠甲減組(maternal hypothyroidism,MH)和對(duì)照組(control),利用抗甲狀腺藥物PTU加入自然飲水的方法制備SD大鼠甲狀腺機(jī)能減退模型。MH組雌鼠與雄鼠交配后的SD孕鼠母體模擬胎兒宮內(nèi)甲減狀態(tài),而對(duì)照組攝入普通飲水,孕期持續(xù)監(jiān)測(cè)甲狀腺激素T4和TSH,以評(píng)價(jià)造模是否成功,此外監(jiān)測(cè)母鼠分娩后甲功,以評(píng)估模型是否具有持久穩(wěn)定性。觀察孕鼠妊娠率、孕期體重增加情況、仔鼠出生后體重和甲狀腺功能,以評(píng)估母鼠甲減圍生期結(jié)局。通過(guò)口服葡萄糖耐量試驗(yàn)觀察雄性仔鼠各觀察時(shí)期糖代謝情況,取兩組實(shí)驗(yàn)大鼠的胰腺組織,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-PCR)及組織免疫染色方法觀察子代各觀察時(shí)期胰島中增殖標(biāo)志蛋白Ki67 mRNA、insulinl mRNA、insulin2 mRNA、TRβ31 mRNA和TRβ2 mRNA及蛋白的表達(dá),以了解母體甲狀腺機(jī)能減退對(duì)子代成年后血糖代謝的影響、胰島細(xì)胞增殖功能和胰島素合成和分泌功能的影響及機(jī)制。細(xì)胞部分:常規(guī)方法培養(yǎng)小鼠胰島細(xì)胞株MIN6細(xì)胞,分別用不同濃度甲狀腺激素T3(10-8、10-7、10-6、10-5、104、10-3、10-2 mM)干預(yù)MIN6細(xì)胞24、48、72小時(shí),用CCK-8(cell counting kit-8,CCK-8)測(cè)定不同時(shí)間段、不同濃度T3對(duì)MIN6細(xì)胞活力的影響,確定T3最佳作用濃度為10-4 mM,最佳作用時(shí)間為72小時(shí),選擇該濃度為干預(yù)濃度。構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)TRβ的小鼠胰島素MIN6細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。將培養(yǎng)的細(xì)胞分為4組:空質(zhì)粒對(duì)照組(NC),空質(zhì)粒對(duì)照+T3干預(yù)組(NC+T3),TRβ過(guò)表達(dá)細(xì)胞組(TRβ),TRβ過(guò)表達(dá)細(xì)胞+T3干預(yù)組(TRβ+T3),觀察72小時(shí),利用葡萄糖刺激胰島素分泌試驗(yàn)(Glucose-stimulated insulin secretion test,GSIS)檢測(cè)每組細(xì)胞胰島素分泌功能,利用RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞Ki67 mRNA、Insulinl mRNA、Insulin2 mRNA表達(dá)水平,以確認(rèn)甲狀腺激素T3是否通過(guò)TRβ發(fā)揮促胰島素分泌作用和細(xì)胞增殖功能。結(jié)果:動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,母鼠甲減組妊娠率為36.36%,低于正常對(duì)照組的70%(p0.05),甲減組孕期體重增長(zhǎng)較正常組下降(118.5±9.5 vs 154.8±9.7g,p0.05)。且母鼠甲減組的雄性仔鼠出生體重明顯低于正常對(duì)照組(5.43±0.10 vs 7.30±0.12g,尸0.001),連續(xù)觀察體重至8周齡母鼠甲減組雄性仔鼠的體重均低于對(duì)照組仔鼠,4周、8周齡時(shí)母鼠甲減組和對(duì)照組體重分別為(74.01±1.75 vs 86.78±2.80g,pp0.01),(130.4±11.48 vs 202.4±9.28g,p0.001)。兩組雄性仔鼠出生時(shí)甲狀腺激素T4水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.37±0.06 vs 0.33±0.02μg/dL,p0.05),而母鼠甲減組仔鼠TSH水平顯著高于對(duì)照組仔鼠(3.08±0.05 vs 2.37±0.28 ng/mL,p0.05),但出生4周后兩組仔鼠TSH、T4水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。母鼠甲減組仔鼠出生當(dāng)天的隨機(jī)血糖為7.05±0.21 mmol/L,高于對(duì)照組6.47±0.10 mmol/L(p0.05),進(jìn)一步對(duì)各觀察時(shí)期仔鼠行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(oral glucose tolerance test,OGTT)顯示母鼠甲減組仔鼠4周齡時(shí)各檢測(cè)點(diǎn)血糖水平與對(duì)照組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而在8周齡時(shí)空腹血糖明顯高于對(duì)照組仔鼠(8.13±0.38 mmol/L vs 6.63±0.19 mmol/L,p0.05),糖負(fù)荷后血糖變化趨勢(shì)與對(duì)照組相似,均出現(xiàn)于15min,但母鼠甲減組血糖值高于對(duì)照組(17.84±0.81 mmol/L vs 14.34±1.21 mmol/L,p0.05)。胰腺組織HE染色顯示,4周齡、8周齡時(shí)甲減組仔鼠胰島形態(tài)結(jié)構(gòu)和正常組無(wú)明顯差異,然而RT-PCR結(jié)果和胰腺組織免疫組化結(jié)果顯示,胰島細(xì)胞胰島素合成和細(xì)胞增殖標(biāo)志物的mRNA和蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照組。體外實(shí)驗(yàn)中,CCK-8結(jié)果顯示甲狀腺激素T3能明顯促進(jìn)MIN6細(xì)胞的增殖,并呈濃度和時(shí)間依賴性,T3最佳作用濃度為10-4mM。通過(guò)RT-PCR發(fā)現(xiàn),NC組MIN6細(xì)胞加入含T3的培養(yǎng)液后,Ki67 mRNA、Insulin1 mRNA、Insulin2 mRNA表達(dá)增加,同時(shí)TRβmRNA表達(dá)上調(diào)。TRβ+T3組細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki67 mRNA的水平較對(duì)照組顯著增加(p0.05)。GSIS顯示,TRβ+T3組的MIN6細(xì)胞經(jīng)高糖刺激后,胰島素釋放量顯著高于NC組細(xì)胞(p0.05)。結(jié)論:母體甲狀腺機(jī)能減退可導(dǎo)致母鼠妊娠率下降,體重增加減少;并導(dǎo)致雄性仔鼠出生后0-8周生長(zhǎng)發(fā)育遲緩,由此認(rèn)為孕期甲狀腺機(jī)能減退與圍生期不良結(jié)局相關(guān)。甲狀腺激素T3有明確的促進(jìn)MIN6細(xì)胞增殖和胰島素分泌的能力,宮內(nèi)甲減可能通過(guò)子代胰腺中TRβ基因適應(yīng)性下調(diào),導(dǎo)致胰腺細(xì)胞增殖、胰島β細(xì)胞分泌胰島素的能力下降,最終導(dǎo)致子代青年期開(kāi)始出現(xiàn)空腹血糖升高及糖耐量異常,故母體甲狀腺激素可能通過(guò)TRβ受體對(duì)子代胰腺細(xì)胞增殖和胰島素分泌發(fā)揮重要的作用,TRβ受體表達(dá)的下調(diào)可能是早發(fā)糖尿病的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。
【圖文】：

出生體重（ｇ）ａ邐７．３±０．２邐５．６±０．１＊＊＊逡逑仔鼠死亡率（％）邐４．３％邐６．７％逡逑生隨機(jī)血糖（ｍｍｏｌ／Ｌ）邐６．４７邋±０．１０邐７．０５邋±０．２１＊逡逑均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用獨(dú)立樣本ｔ檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，與對(duì)照組相比，＊／７＜０．＾＜０．００１逡逑ｎ邋土邋ＳＥＭ．邋＊／？＜０．０５邋ｖｓ．邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋＊＊＊／？邋＜邋０．００１邋ｖｓ．邋ｃｏｎｔｒｏｌ．邋ＭＨ：邋ｍａｔｅｒｎａｌ邋ｈｙｐｏｔｈｙ一般資料見(jiàn)表４。同對(duì)照組比較，甲減組妊娠周期延長(zhǎng)，產(chǎn)子意義。而甲減組的妊娠率較對(duì)照組明顯降低（ｐ＜邋０．０５），，孕期），仔鼠出生體重較對(duì)照組明顯減輕（ｐ＜０．００１），且出生時(shí)隨機(jī)0．0５）。逡逑仔鼠生長(zhǎng)發(fā)育的影響逡逑鼠甲減所致的胎兒宮內(nèi)甲減環(huán)境是否對(duì)仔鼠的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生不鼠出生后體重變化。其結(jié)果如下圖。逡逑２５０－．逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌｒｏｕ

邐南京中醫(yī)藥大學(xué)博士學(xué)位論文雄性仔鼠基線資料顯示，兩組仔鼠出生時(shí)，甲減母鼠組的體重明顯低于對(duì)照組（ｐ＜０．００１），兩組仔鼠出生后體重隨著年齡的增長(zhǎng)而增長(zhǎng)，體重變化趨勢(shì)相似。ＭＨ組仔鼠逡逑出生后２周、４周、６周、８周齡，ＭＨ組仔鼠的體重都顯著低于對(duì)照組仔鼠（ｐ＜０．０５）逡逑４．母鼠甲減對(duì)子代糖代謝的影響逡逑為了觀察母鼠甲減對(duì)子代糖代謝的影響，我們通過(guò)口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（Ｏｒａｌ逡逑ｇｌｕｃｏｓｅ邋ｔｏｌｅｒａｎｃｅ邋ｔｅｓｔ，ＯＧＴＴ），對(duì)出生后４周及８周的雄性仔鼠測(cè)定空腹、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、逡逑６０ｍｉｎ、１２０ｍｉｎ的血團(tuán)葡萄糖水平及葡萄糖曲線下面積（Ａｒｅａ邋ｕｎｄｅｒ邋ｃｕｒｖｅ，ＡＵＣ）進(jìn)行逡逑比較。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑２０－１邐１５００－邐—Ｉ—逡逑
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R363

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本文編號(hào)：2640784