發(fā)布時間：2020-04-25 03:16

【摘要】：背景:SIRT2(Silent information regulator 2)是NAD~+依賴性的去乙酰化酶,它是Sirtuins家族的重要成員之一。SIRT2它不僅主要存在于細胞質(zhì)中,還可以移位至細胞核中發(fā)揮其相關的功能作用。最近的研究表明,SIRT2參與多種細胞過程,其中包括能量代謝、細胞增殖、細胞分化、細胞凋亡、細胞老化和代謝、基因組的穩(wěn)定性、炎癥、壽命和腫瘤的發(fā)生等。在過去的幾年中,已經(jīng)鑒定出許多SIRT2的蛋白底物,SIRT2能使多種蛋白底物去乙酰化并參與許多細胞過程,其中包括炎癥的調(diào)節(jié)。然而,其在炎癥過程中的確切作用尚未完全闡明。我們之前的研究結果發(fā)現(xiàn)了與SIRT2相互作用的新的底物蛋白熱休克蛋白(Heat Shock Protein 90,Hsp90?),在此基礎上進行研究和探索SIRT2與Hsp90?之間的相互作用以及探索對其下游炎性因子表達的調(diào)控作用機制。為今后開發(fā)靶向SIRT2調(diào)節(jié)與炎癥相關疾病的免疫應答提供了新理論依據(jù)和治療思路。目的:我們在前期已經(jīng)鑒定出SIRT2新型底物蛋白Hsp90的基礎上,進一步驗證SIRT2與熱休克蛋白Hsp90之間的相互調(diào)節(jié)關系,然后利用實驗室已經(jīng)SIRT2穩(wěn)定過表達或沉默的細胞系B104來分析SIRT2對Hsp90及其下游炎癥因子的調(diào)控作用。首先是檢測SIRT2對Hsp90蛋白乙酰化水平的影響;其次是檢測SIRT2對Hsp90與糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid reccptor,GR)之間相互作用的影響;接著進一步檢測SIRT2過表達對GR亞細胞定位的影響及其轉(zhuǎn)錄活性的影響;最后通過一系列的實驗檢測SIRT2對Hsp90下游炎性因子表達水平的調(diào)控,來進一步分析其作用的細胞生物學功能。方法:首先,我們利用GST-pulldown實驗和Co-IP實驗來進一步驗證SIRT2和熱休克蛋白Hsp90之間的相互作用。再通過對已經(jīng)篩選穩(wěn)定的SIRT2過表達或沉默的細胞系進行細胞的復蘇和培養(yǎng),然后收細胞提取蛋白質(zhì),并進行Co-IP實驗以檢查SIRT2與Hsp90蛋白質(zhì)是否結合在一起。接著利用Co-IP實驗檢測了SIRT2對Hsp90與糖皮質(zhì)受體GR之間相互作用的影響。然后通過核質(zhì)分離實驗檢測SIRT2過表達對GR亞細胞定位的影響。與此同時,利用熒光素酶報告基因?qū)嶒瀬頇z測SIRT2過表達對糖皮質(zhì)激素受體GR轉(zhuǎn)錄活性的影響。最后,我們分別通過qPCR和Western blot技術檢測SIRT2對Hsp90下游炎性因子在mRNA水平和蛋白水平的影響,通過PCR將Hsp90突變,分別產(chǎn)生模擬乙酰化和無乙酰化突變質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Jurkat細胞,然后在確定兩種突變體都過表達后,在有或沒有脂多糖LPS刺激的情況下,利用Western blot的方法來進一步驗證Hsp90K294的乙�；欠裨诮閷а仔砸蜃拥谋磉_中起著重要的作用,分析可能的信號傳導途徑。結果:1.我們通過GST-pulldown實驗和Co-IP實驗來進一步驗證SIRT2與熱休克蛋白Hsp90之間的相互作用,結果發(fā)現(xiàn)能夠檢測到SIRT2與Hsp90結合的條帶,并且與沒有脂多糖LPS的刺激下相比,在有LPS刺激的B104細胞中,SIRT2和Hsp90之間的結合作用似乎更強些。而且也同樣在B104細胞中能夠檢測到SIRT2與Hsp90結合的條帶。2.在研究SIRT2與Hsp90之間的功能關系的Co-IP實驗結果顯示,雖然在SIRT2過表達和對照組細胞中Hsp90總蛋白水平相當,且SIRT2過表達并未引起Hsp90總蛋白水平的變化,但是SIRT2過表達后Hsp90乙�；匠尸F(xiàn)降低的趨勢。相反,與總的Hsp90表達水平相比,SIRT2沉默的B104細胞中Hsp90乙�；匠尸F(xiàn)升高的趨勢,表明SIRT2對B104細胞中的Hsp90具有去乙酰化作用。3.接著我們利用co-IP的實驗方法來檢測SIRT2對Hsp90與糖皮質(zhì)受體GR之間相互作用的影響。我們利用抗Hsp90的抗體進行IP測定,結果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,SIRT2過表達的B104細胞中糖皮質(zhì)激素受體GR與Hsp90的結合量減少。相反,SIRT2沉默的B104細胞中糖皮質(zhì)激素受體GR與Hsp90的結合量增加。我們利用抗GR的抗體進行IP測定,并且發(fā)現(xiàn)與使用Hsp90抗體的IP測量結果是相似的。與具有或不具有脂多糖LPS刺激的對照組相比,過表達SIRT2的B104細胞中GR與Hsp90的結合量減少。相反,SIRT2沉默的B104細胞中糖皮質(zhì)激素受體GR與Hsp90的結合量增加。更有趣的是我們用抗乙酰化的Hsp90抗體進行測定,SIRT2過表達或沉默的B104細胞中Hsp90與GR的相互作用水平對應于SIRT2過表達或沉默對Hsp90乙�；降挠绊�,這些結果證明SIRT2通過Hsp90的去乙酰化促進GR與Hsp90的解離。4.隨后我們又通過核質(zhì)分離實驗發(fā)現(xiàn),在SIRT2過表達的B104細胞中,細胞核中GR的蛋白水平高于細胞質(zhì)中的水平。相反,在SIRT2沉默的B104細胞中,細胞核中GR的蛋白水平低于細胞質(zhì)中的蛋白水平。這些結果說明Sitr2過表達改變了細胞核和細胞質(zhì)GR的比例,表明SIRT2通過Hsp90的去乙酰化,誘導其與GR解離,最終導致GR易位至細胞核。5.我們又通過熒光素酶報告基因?qū)嶒灉y定SIRT2對B104細胞中的GR與其糖皮質(zhì)激素反應元件GRE(Glucocorticoid receptor response elements,GRE)之間結合能力的影響。首先用Western blot驗證SIRT2在B104細胞中確實是過表達或沉默了,以進一步的確認了該熒光素酶報告基因測定結果的可靠性。然后在此基礎上進行了熒光素酶報告基因的實驗,結果顯示,與對照細胞相比,SIRT2過表達增強了熒光素酶報告基因的表達。相反,SIRT2沉默減弱了熒光素酶報告基因的表達,表明了SIRT2能夠有效的增加GR的轉(zhuǎn)錄活性。6.緊接著,我們通過Western檢測了6種細胞系中SIRT2以及細胞因子TNFα,IL-1β和IL-6的表達。發(fā)現(xiàn)在這6種細胞系中Jurkat細胞能夠同時表達SIRT2和上述3種細胞因子。于是我們利用該細胞分別通過qPCR和Western blot的實驗方法檢測SIRT2對Hsp90下游炎性因子表達水平的影響。結果顯示在有或沒有脂多糖LPS的刺激下,與對照組相比,不管是在mRNA水平還是在蛋白水平上,SIRT2過表達抑制炎性細胞因子的表達,而SIRT2沉默促進炎性細胞因子的表達。結果還發(fā)現(xiàn),在有脂多糖LPS的刺激下,與SIRT2沉默相比,SIRT2過表達更能夠顯著的抑制炎性細胞因子的表達。7.最后,我們?yōu)榱舜_定Hsp90 K294的乙酰化是否在介導炎性因子的表達中起著重要的作用。我們構建了Hsp90的模擬乙酰化(K294Q)和Hsp90無乙�；�(K294R)的突變體,對Jurkat細胞進行Western分析,結果顯示Hsp90的兩個突變體均過表達。然后在SIRT2過表達或沉默的Jurkat細胞中過表達這兩個突變體,分別用或不用脂多糖LPS處理后進行Western blot檢測,結果發(fā)現(xiàn),Hsp90乙�；M突變與使用或不使用LPS刺激的Hsp90無乙酰化突變相比,這3種炎性因子的表達水平增加。并且還發(fā)現(xiàn),與野生型的Hsp90相比,Hsp90模擬乙酰化(K294Q)突變體幾乎消除了Jurkat細胞中SIRT2過表達或沉默的影響,更有趣的是,與對照相比,脂多糖LPS的刺激似乎對Hsp90模擬突變體(K294Q)Jurkat細胞中的炎性細胞因子的表達影響更大。這些結果充分證明了SIRT2在炎癥反應中的抑制作用。結論:SIRT2與Hsp90在體外和體內(nèi)都能夠結合并通過對Hsp90去乙�；�,促進糖皮質(zhì)激素受體GR與Hsp90的解離,最終導致GR移位到細胞核中并促進GR與GRE的結合可能抑制炎性細胞因子的表達。
【圖文】：

3 實驗結果3 實驗結果3.1 在 B104 細胞中 SIRT2 與 Hsp90 的結合情況3.1.1 GST-pulldown 驗證 SIRT2 與 Hsp90 的結合我們?yōu)榱俗C實 SIRT2 和 Hsp90 之間的結合作用，先將 GST-SIRT2 融合蛋白結合在谷胱甘肽瓊脂糖珠上，，然后在有或沒有脂多糖 LPS 刺激的情況下下拉 B104 細胞中的Hsp90。如下圖所示，與單獨的 GST 對照相比，在有或沒有 LPS 刺激的條件下，GST-SIRT2都能夠從 B104 細胞中檢測到 SIRT2 與 Hsp90 的結合量。

圖 3.1.2 免疫共沉淀檢測內(nèi)源性 SIRT2 與 Hsp90 的結果圖。用抗 Hsp90 和抗 SIRT2 進行的免疫共沉淀情況（A）。用抗 SIRT2 和抗 Hsp90 進行的免疫共沉淀的情況（B）。所有實驗的測定重復至少三次產(chǎn)生類似的結果，并顯示代表性的免疫印跡。3.2 SIRT2 對 Hsp90 乙�；降挠绊懳覀�?yōu)榱舜_定 SIRT2 與 Hsp90 之間的功能關系，首先利用實驗室已經(jīng)用 SIRT2 過表達或沉默的慢病毒感染并且篩選穩(wěn)定的B104細胞系進行了IP實驗，結果如下圖所示用抗 Hsp90 的 IP 顯示，在 SIRT2 過表達和對照的細胞中檢測到相似的總的 Hsp90 蛋白量。然而，相對于總的 Hsp90 表達水平相比，SIRT2 過表達的 B104 細胞中的 Hsp90 乙酰化水平呈現(xiàn)降低的趨勢（如圖 A 所示）。相反，與總的 Hsp90 表達水平相比，SIRT沉默的 B104 細胞中的 Hsp90 乙酰化水平呈現(xiàn)升高的趨勢（如圖 B 所示），證明 SIRT對 B104 細胞中的 Hsp90 具有去乙酰化作用。
【學位授予單位】：河南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R363

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