【摘要】：微小RNAs(microRNAs,miRNAs)通過抑制mRNA翻譯在間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化中發(fā)揮關(guān)鍵作用,而許多miRNAs的調(diào)控機(jī)制仍不清楚。在本研究中,我們探討了miR-503-3p在張應(yīng)力下調(diào)控人脂肪干細(xì)胞(human adipose-derived stem cells,hASCs)成骨分化的作用機(jī)制。流式細(xì)胞儀檢測免疫表型實(shí)驗(yàn)以及干細(xì)胞多向分化潛能實(shí)驗(yàn)證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞是hASCs。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示,miR-503-3p直接靶向結(jié)合Wnt7b的3'端非翻譯區(qū)(3'-UTR),以調(diào)節(jié)其表達(dá)水平。張應(yīng)力下通過miR-503-3p mimic和inhibitor對miR-503-3p表達(dá)進(jìn)行增強(qiáng)或抑制后表明,miR-503-3p的低表達(dá)顯著促進(jìn)hASCs的成骨分化,而miR-503-3p過表達(dá)則抑制成骨分化。進(jìn)一步的研究結(jié)果表明,miR-503-3p過表達(dá)抑制Wnt7b的表達(dá),從而抑制Wnt/β-cantenin途徑。相反,miR-503-3p低表達(dá)促進(jìn)Wnt7b的表達(dá),進(jìn)而激活Wnt/β-cantenin途徑。綜上所述,我們的研究結(jié)果表明張應(yīng)力抑制了hASCs中miR-503-3p的表達(dá),靶向促進(jìn)Wnt7b的表達(dá),進(jìn)而激活Wnt/β-catenin途徑,促進(jìn)hASCs的成骨分化。因此,miR-503-3p是hASCs成骨分化中的負(fù)向調(diào)節(jié)因子。目的:探討miR-503-3p靶向調(diào)控Wnt7b對hASCs成骨分化的影響。本項(xiàng)研究結(jié)果將為促進(jìn)力學(xué)因素在組織工程化骨組織構(gòu)建中的應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法:收集患者自愿捐獻(xiàn)的人脂肪組織,分離、獲取hASCs,經(jīng)干細(xì)胞多向分化及流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行干細(xì)胞表面標(biāo)志物初步鑒定后,選取3-5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。Cell Counting Kit-8(CCK-8)檢測hASCs細(xì)胞增殖的影響;流式細(xì)胞儀檢測其對周期的影響;油紅O染色檢測hASCs成脂誘導(dǎo)后的成脂分化;堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性和茜素紅染色測定hASCs成骨誘導(dǎo)后的成骨分化;阿利新藍(lán)染色和檢測hASCs成軟骨誘導(dǎo)后的成軟骨分化;分別對hASCs加載周期性單軸張應(yīng)力(5%,0.5Hz,2 h/d)6 d;熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證Wnt7b是否為miR-503-3p的靶基因;構(gòu)建Wnt7b-siRNA干擾片段,通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hASCs,實(shí)時定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)法檢測miR-503-3p的mimic和inhibitor及si-Wnt7b轉(zhuǎn)染效率;分別用qPCR和蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)檢測成骨分化相關(guān)的Runt-相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)、ALP、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine,SPARC)、Wnt7b和β-連環(huán)蛋白(β-catenin)的mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果:干細(xì)胞多向分化潛能檢測及細(xì)胞表面標(biāo)記物鑒定證明分離提取的hASCs為間充質(zhì)細(xì)胞;張應(yīng)力下hASCs成骨分化增強(qiáng);Wnt7b是miR-503-3p的靶基因;Wnt7b過表達(dá)促進(jìn)張應(yīng)力下hASCs成骨分化,而Wnt7b低表達(dá)抑制張應(yīng)力下hASCs成骨分化;上調(diào)miR-503-3p抑制張應(yīng)力下hASCs成骨分化作用,而下調(diào)miR-503-3p促進(jìn)張應(yīng)力下hASCs成骨分化作用;Wnt7b過表達(dá)彌補(bǔ)miR-503-3p mimic的抑制成骨分化功能,而Wnt7b低表達(dá)削弱miR-503-3p inhibitor的增強(qiáng)張應(yīng)力促成骨分化功能。結(jié)論:張應(yīng)力通過下調(diào)miR-503-3p表達(dá)靶向增高Wnt7b表達(dá)促進(jìn)人脂肪干細(xì)胞成骨分化,此結(jié)果為促進(jìn)力學(xué)因素在組織工程化骨組織構(gòu)建中的應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1 第 3 代人脂肪干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察（100×）ological observation of passage 3 human adipose-deri胞周期能力胞增殖情況，，繪制生長曲線為“S”的總體形狀為 3-6 d，細(xì)胞增殖率顯著增加時；平臺期 2）。

圖 2 第 3 代人脂肪干細(xì)胞的生長曲線re 2 The growth curve of passage 3 human adipose-derivedste結(jié)果（圖 3）表明：本實(shí)驗(yàn)獲取的 hASCs 有 86.93.09% ± 2.64%處于 S/G2 期。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R329.2

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本文編號：2638353