【摘要】：【目的】人類腺病毒(HAdV)3、7和55型可引起急性呼吸道疾病流行和暴發(fā)。1、研究并探討一株抗人3、7和55型腺病毒三價疫苗候選株,為腺病毒疫苗研究奠定基礎(chǔ)。2.鑒定中和抗原對監(jiān)測疫情和疫苗開發(fā)至關(guān)重要,以人三型腺病毒為基礎(chǔ),構(gòu)建7型腺病毒纖毛頭和六鄰體蛋白嵌合型重組腺病毒,研究產(chǎn)生主要中和抗體的抗原。3、構(gòu)建人5型腺病毒纖毛蛋白嵌合型重組人三型腺病毒,研究其對類動物細胞的感染性。【方法】一、通過同源重組,將含有HAdV-55六鄰體的片段pSKE3LR-h55中的HAdV-55六鄰體(h55)重組到含有HAdV-3和HAdV-7六鄰體的質(zhì)粒p BRAd-MHE3中,得到的三價腺病毒質(zhì)粒命名為p BRAd-MHE3-h55。在二價疫苗rAdMHE3的E3區(qū)表達HAdV-55的六鄰體,包裝出重組抗人3、7和55型腺病毒三價疫苗候選株rAdMHE3-h55。測定重組腺病毒的生長曲線用來分析其生長特性,使用小鼠血清對重組病毒進行的體外中和試驗。使用rAdMHE3-h55免疫小鼠,分別用HAdV-3、HAdV-7和HAdV-55滴鼻攻毒,取肺組織進行Q-PCR檢測、HE染色,檢測重組腺病毒對小鼠的保護力。通過PCR擴增人7型腺病毒的纖毛頭基因,與人3型腺病毒載體進行同源重組,包裝出含Ad3E骨架和HAdV-7纖毛頭的重組衣殼嵌合人腺病毒rAd3E-Fk7。通過PCR獲得的人7型腺病毒的六鄰體基因替換p Ad3E-Fk7的3型六鄰體,包裝出含有Ad3E骨架和HAdV-7六鄰體和纖毛頭的重組衣殼嵌合人腺病毒rAd3E-H7Fk7。測定重組腺病毒的生長曲線用來分析其生長特性,使用小鼠和人血清對嵌合腺病毒進行的體外中和試驗。使用純化的病毒HAdV-3、HAdV-7和rAd3E-H7Fk7免疫小鼠獲得血清進行體外中和實驗,在人血清中對重組腺病毒進行中和試驗。三、通過PCR擴增人5型腺病毒的纖毛頭基因,與人3型腺病毒載體進行同源重組,包裝出包含Ad3E骨架和HAdV-5纖毛頭的重組衣殼嵌合人腺病毒rAd3E-Fk5。測定重組腺病毒的生長曲線用來分析其生長特性。重組人腺病毒rAd3E-Fk5感染小鼠原代腎上皮細胞、金倉鼠原代腎上皮細胞以及測定rAd3E-Fk5在金倉鼠原代細胞內(nèi)晚期基因的表達�！窘Y(jié)果】一、成功包裝出了重組抗人3、7和55型腺病毒三價疫苗候選株rAdMHE3-h55。重組三價病毒rAdMHE3-h55表達HAdV-55的六鄰體蛋白并且具有與其對應(yīng)的野生型HAdV-3有相似的復(fù)制動力學。小鼠抗-rAdMHE3-h55對HAdV-3、HAdV-7、HAdV-55和rAdMHE3-h55產(chǎn)生強應(yīng)答,而小鼠抗-HAdV-55僅針對HAdV-55和rAdMHE3-h55的產(chǎn)生應(yīng)答。這些發(fā)現(xiàn)證實,重組腺病毒rAdMHE3-h55能夠在小鼠中誘導免疫應(yīng)答,并且產(chǎn)生針對HAdV-3、HAdV-7和HAdV-55的抗體。用rAdMHE3-h55接種可BALB/c小鼠,使用HAdV-3、HAdV-7和HAdV-55對其進行滴鼻感染,發(fā)現(xiàn)第五天,免疫后的小鼠對三種病毒都能有效的清除。我們的體外和體內(nèi)研究表明,rAdMHE3-h55不僅能夠誘導針對HAdV3、HAdV7和HAdV55的中和抗體,而且使用HAdV-3、HAdV-7或HAdV-55對小鼠進行滴鼻攻毒,rAdMHE3-h55免疫對小鼠能明顯產(chǎn)生保護作用。二、成功構(gòu)建了重組腺病毒rAd3E-Fk7和rAd3E-H7Fk7。重組腺病毒rAd3E-Fk7、rAd3E-H7Fk7與野生型腺病毒具有相同的復(fù)制曲線。用嵌合腺病毒進行體外中和實驗表明,六鄰體和纖毛頭蛋白能誘導產(chǎn)生針對HAdV-3和HAdV-7的中和抗體。對人血清進行體外中和實驗,顯示六鄰體和纖毛頭蛋白能產(chǎn)生HAdV-3或HAdV-7的中和抗體�？傊�,HAdV-3和HAdV-7中的六鄰體蛋白和纖毛頭蛋白都可能是誘導中和抗體應(yīng)答。研究結(jié)果對腺病毒疫苗和藥物開發(fā)有重要意義。三、成功構(gòu)建了重組人五型腺病毒纖毛頭蛋白嵌合型重組人3型腺病毒rAd3E-Fk5。結(jié)果顯示rAd3E-Fk5病毒在金倉鼠原代細胞內(nèi)有顯著增殖。而rAd3E病毒在金倉鼠原代細胞內(nèi)沒有顯著增殖。人3型腺病毒rAd3E對小鼠腎原代細胞感染能力低,而纖毛蛋白嵌合型重組人3型腺病毒rAd3E-Fk5的感染力高,與對照人5型腺病毒rAd5E感染力相近。rAd3E-Fk5在金倉鼠原代細胞內(nèi)有晚期基因的表達�？梢杂糜谌�3型腺病毒疫苗評價、抗病毒藥物評價、致病機制的小鼠、金倉鼠動物模型中�！窘Y(jié)論】一、重組腺病毒rAdMHE3-h55能夠在小鼠中誘導免疫應(yīng)答,并且產(chǎn)生針對HAdV-3、HAdV-7和HAdV-55的抗體。對重組腺病毒疫苗的開發(fā)有重要意義。二、HAdV-3和HAdV-7中的六鄰體蛋白和纖毛頭蛋白都可能是誘導中和抗體應(yīng)答。因此可能對腺病毒疫苗和藥物開發(fā)很重要。三、纖毛蛋白嵌合型重組人3型腺病毒rAd3E-Fk5在體外可以感染小鼠腎原代上皮細胞、金倉鼠腎原代細胞,其感染效率與HAdV-5相近,相比其母毒株rAd3E其感染效率要高得多,rAd3E-Fk5在金倉鼠細胞內(nèi)有顯著復(fù)制,可以用于人3型腺病毒疫苗評價、抗病毒藥物評價、致病機制等動物模型中。
【圖文】：

允許 3.5A 分辨率的 X 射線衍射來確定該病毒的結(jié)構(gòu)。病毒結(jié)構(gòu)揭示了內(nèi)外殼表面上的主要和次要蛋白的位置、折疊和相互作用。如圖 1.2 所示，新的結(jié)構(gòu)信息進一步闡明了腺病毒衣殼包裝和病毒-宿主細胞相互作用的[47]。

圖 1.3 腺病毒的入胞[77] 纖毛和受體結(jié)合 五鄰體與整聯(lián)素結(jié)合介導內(nèi)化 病毒經(jīng)受早期內(nèi)含體內(nèi)環(huán)境，，釋放頂角蛋白 ④pVI 破壞內(nèi)含體膜致病毒從內(nèi)含體中逃離 ⑤部分脫殼維管運輸?shù)胶丝讖?fù)合體 ⑥在核孔復(fù)合體病毒 DNA 脫殼入核
【學位授予單位】：廣州醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R373.1

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本文編號：2637581