【摘要】：心律失常是最為嚴重的心血管疾病之一,是指心臟節(jié)律或是速率失調或者出現(xiàn)障礙導致的一系列疾病。心房顫動是最為常見的心律失常,是一種高致殘性和致死性的疾病。目前通過對房顫家系以及病例的遺傳學研究和全基因組關聯(lián)分析的應用,已發(fā)現(xiàn)多個房顫致病/易感基因。這些遺傳學研究成果為了解房顫的發(fā)生提供了一個廣闊的視角,對研究如何預防和治療房顫提供了寶貴的思路。2008年,我們團隊通過研究一個房顫家系,發(fā)現(xiàn)其致病基因為NUP155。NUP155是首次發(fā)現(xiàn)的非離子通道類的房顫致病基因,這一發(fā)現(xiàn)為理解房顫的發(fā)病機理以及治療提供了更開闊的視角。GLE1基因是一個保守的mRNA出核轉運調控因子。另外,GLE1在轉錄的起始和終止過程中也發(fā)揮重要的作用。有研究報道NUP155和GLE1二者在細胞內是存在著相互作用的,它們在核孔復合體中共同作用發(fā)揮調控mRNA出核轉運的任務。由此可見,GLE1基因是一個基因轉錄后調控的關鍵調控因子。本研究中主要使用斑馬魚作為實驗材料,研究nup155和gle1在斑馬魚胚胎心臟發(fā)育過程中的作用,以期解析它們在心血管系統(tǒng)的生理功能。分別使用注射MO(Morpholino Oligos)和mRNA來敲低和過表達nup155和gle1,進而探索它們對斑馬魚早期發(fā)育過程中心臟的結構和功能的影響,以期望探索nup155和gle1的重要生理功能,這些研究對了解房顫發(fā)生的分子機制具有一定的意義。表達譜結果表明nup155的mRNA信號在單細胞期就已經出現(xiàn)。這一結果表明nup155在卵子發(fā)生中就開始表達。從二細胞期開始,nup155呈現(xiàn)一個泛表達的情況。通過比對gle1在斑馬魚中的表達譜,發(fā)現(xiàn)nup155和gle1表達位置具有高度的一致性。二者在卵子中就開始表達,之后的各個時期均表現(xiàn)出泛表達的現(xiàn)象,這些區(qū)域正是早期細胞分裂活動強烈的地方。這些結果表明nup155和gle1的表達伴隨著斑馬魚的胚胎發(fā)育過程,可能同nup155和gle11調控細胞mRNA的出核轉運過程有關,同時這些實驗結果還提示nup155和gle1在胚胎發(fā)育過程中的重要作用。將心臟單獨分離出來進行實時定量PCR檢測,發(fā)現(xiàn)nup155和gle1在24 hpf,48hpf以及成魚心臟中均有表達。實驗結果還表明nup155和gle1的基因表達下調會影響調控心臟發(fā)育的轉錄因子的表達。nkx2.5在nup155和gle1敲低之后有顯著的下調。同時,敲低gle1還會使gata4的表達下調,而二者均不影響hand2的表達。在48 hpf,通過對心肌細胞的標記物cmlc2檢測,發(fā)現(xiàn)nup155基因敲低后,心室的內徑明顯的變小,整個形態(tài)結構發(fā)生了明顯的變化。gle1基因敲低后,斑馬魚胚胎表現(xiàn)出了左右不對稱發(fā)育的表型,心臟的正常的環(huán)化受到了影響。進一步的實驗表明左右不對稱發(fā)生過程中的調控因子spaw和pitx2以及特異性顯示胰臟的標記物ins的表達也發(fā)生了改變。這些結果表明nup155和gle1在心臟發(fā)育過程中發(fā)揮了重要功能。之后進一步研究了nup155和gle1對于斑馬魚心臟的心率和動作電位的影響。通過記錄和分析48 hpf斑馬魚的心率改變,結果發(fā)現(xiàn)敲低nup155和gle1的基因表達能夠使斑馬魚心率的顯著上調。同時通過實時定量PCR檢測調控斑馬魚心率的相關基因hcn4,cav1.3,kcnj2和scn5a的表達情況,結果發(fā)現(xiàn)hcn4在nup155和gle1基因敲低之后顯著下降,這一結果說明nup155和gle1可能是通過hcn4來影響斑馬魚的心率改變的。在房顫的發(fā)生過程中一個重要的因素就是心肌細胞動作電位的變化,所以之后對斑馬魚心臟的動作電位進行了檢測。結果發(fā)現(xiàn)在nup155敲低之后,斑馬魚的動作電位APD_(90)也發(fā)生顯著下調,而實時定量PCR的結果表明這一過程中nup155可能是通過調控kcnq1表達來實現(xiàn)的。但是敲低gle1基因并未影響斑馬魚動作電位。這些結果表明nup155可能是通過調控離子通道基因hcn4和kcnq1影響斑馬魚心率與動作電位。通過原位雜交檢測敲低nup155和gle1基因后胚胎動脈血管的和靜脈血管的標記物,結果發(fā)現(xiàn)它們的表達均未發(fā)生變化,說明nup155和gle1基因可能只影響心臟的發(fā)育,而不影響血管發(fā)育。在以上實驗中,能夠使用nup155和gle1 mRNA將敲低nup155和gle1后的表型拯救到正常水平,說明了nup155和gle1 MO作用的特異性。綜上所述,研究中發(fā)現(xiàn)nup155通過nkx2.5調控了心臟在胚胎發(fā)育階段的形態(tài)發(fā)生,通過調控hcn4和kcnq1來影響胚胎心臟的心率和動作電位等電生理活動。而這些基因與房顫的發(fā)生都密切相關。同時發(fā)現(xiàn)與nup155相互作用的gle1也有類似的生理功能,通過nkx2.5和gata4影響心臟在胚胎發(fā)育階段的形態(tài)發(fā)生,通過調控hcn4影響胚胎心臟的心率。這些結果揭示了nup155和gle1新的生理功能,同時對進一步認識nup155誘導房顫發(fā)生的分子機制有一定的指導意義。
【圖文】：

華 中 科 技 大 學 博 士 學 位 論 文在雞和小鼠中，心臟神經嵴（Cardiac neural crests）是顱神經嵴的一個次區(qū)域，起源于耳廓和體節(jié) 3。對于形成主動脈瓣間隔的形成，將心臟動脈分為體循環(huán)和肺循環(huán)有巨大的作用[45]。而在斑馬魚中由于沒有主動脈瓣間隔，心臟神經嵴起源于體節(jié) 1，，主要負責分化為心臟流出道，心室，心房內流入道處的心肌細胞[33]。

過程成為心管融合。兩個心室前體群之間的初始接觸是在相對靠后的位置建立的（圖1.2 C）。接下來，初始連接處后面的心肌細胞彼此連接，形成 V 形。最后，兩個群體的最前部連接，形成與中央腔的前邊界（圖 1.2 D - F）。從背側觀察，這種結構看起來像一圈心房細胞被心房細胞環(huán)包圍（圖 1.2 E）。從側面看，很明顯心肌細胞形成淺錐，其心室頂端在其心房基部上方背側凸起（圖 1.2 F）[46]。（3）心管組建在 24 hpf，心管融合后，心臟繼續(xù)延伸，逐漸轉變?yōu)榫�性心管。通過其頂點朝向胚胎右側傾斜來啟動錐體延伸，然后錐體延長，向后伸展（圖 1.2 G- H）。最終，所有心肌細胞合并成具有離散的心室和心房末端的管（圖 1.2 I）。隨著心管的形成，心內膜細胞形成其內層
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R541.75;R-332

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