【摘要】：目的分離和鑒定發(fā)熱伴血小板減少綜合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome,SFTS)病毒株系,獲得全基因組序列信息以及鑒定病毒基因型。重組表達(dá)SFTS病毒包膜蛋白Gn-Gc,構(gòu)建SFTS病毒包膜蛋白Gn-Gc表達(dá)載體,實現(xiàn)包膜蛋白Gn-Gc可溶性表達(dá)。方法1、采集14例浙江省SFTS病毒標(biāo)本,利用Vero細(xì)胞培養(yǎng)并分離病毒,提取病毒核酸并鑒定。2、對其中3株病毒分別采用隨機(jī)引物建庫法和oligo(d T)磁珠抓取RNA建庫法進(jìn)行建庫,利用NGS測序平臺檢測病毒核酸序列,將測序結(jié)果進(jìn)行比較后,建立針對SFTS病毒的建庫方法。3、對14株病毒進(jìn)行高通量測序,將病毒S、M和L片段序列與Gen Bank上40株不同SFTS病毒基因型序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹并分析。4、根據(jù)SFTS病毒Gn-Gc基因序列,截取3126個蛋白編碼堿基,插入到載體p ET-His中,轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中表達(dá)并純化。5、通過SDS-PAGE電泳和Western-blot方法驗證表達(dá)的目的蛋白。結(jié)果1、采集的14例標(biāo)本盲傳3代,第3代時培養(yǎng)至第5天細(xì)胞出現(xiàn)病變,7天后細(xì)胞脫落。提取病毒核酸進(jìn)行熒光定量RT-PCR,Ct值均小于35,為陽性。2、oligo(dT)磁珠抓取建庫法相比隨機(jī)引物建庫法,具有更大的優(yōu)勢。隨機(jī)引物建庫法的測序深度和覆蓋度均低于oligo(d T)磁珠抓取建庫法,且后者測序深度在900以上,覆蓋度超過99%。將測序獲得的3例標(biāo)本基因組序列與參考株序列比對,與NCBI上基因組序列平均匹配率約為94.5%。3、將測序獲得的14株病毒序列與Gen Bank上不同基因型的序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,發(fā)現(xiàn)所有標(biāo)本被分為兩種病毒基因型,D型和E型。4、構(gòu)建了表達(dá)載體p ET-His-Gn-Gc,提取的重組質(zhì)粒和酶切片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示與測序結(jié)果相一致。5、表達(dá)的重組蛋白Gn-Gc理論大小約為100k Da,SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示在100k Da附進(jìn)出現(xiàn)明顯條帶。Western-blot檢測結(jié)果顯示在100k Da附近出現(xiàn)一條明顯主帶。結(jié)論建立了針對SFTS病毒的高效、特異的高通量測序建庫方法,并對近幾年浙江省SFTS病毒毒株進(jìn)行了測序分析和分型。成功構(gòu)建了可溶性表達(dá)SFTS病毒表面蛋白Gn-Gc的載體,建立了穩(wěn)定的Gn-Gc表達(dá)、純化體系,為后續(xù)研究SFTS病毒包膜蛋白結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

(A)正常 Vero 細(xì)胞；(B)接種病毒培養(yǎng) 5 天細(xì)胞出現(xiàn) CPE圖 1 SFTS 病毒接種 Vero 細(xì)胞產(chǎn)生病變表 5 14 例標(biāo)本信息和 Ct 值編號 性別 年齡 地區(qū) 職業(yè) 年份 Ct 值

核酸毛細(xì)管電泳分析
【學(xué)位授予單位】：浙江中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R373

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 寧立中;快速、簡易和經(jīng)濟(jì)的檢測HIV抗體的篩選試驗[J];國外醫(yī)學(xué)(兒科學(xué)分冊);1988年05期

2 育巍;;血管腸肽與艾滋病[J];國外醫(yī)學(xué)情報;1988年11期

3 張玉勤;;HIV-1包膜蛋白可改變血腦屏障的完整性[J];國外醫(yī)學(xué)情報;2000年02期

4 林亞英;丁細(xì)霞;朱偉;陳月;潘玉先;郝衛(wèi);狄飚;溫坤;;Ⅰ型登革病毒包膜蛋白Ⅲ區(qū)中和抗體的制備與鑒定[J];免疫學(xué)雜志;2015年08期

5 郭勇暉;;登革病毒重組包膜蛋白表達(dá)及其應(yīng)用的研究進(jìn)展[J];廣東醫(yī)學(xué);2012年09期

6 邸雅南,胡大榮,熊錦華,胡學(xué)玲,李娟,范公忍,吳憶貧;包膜蛋白突變對乙型肝炎病毒包裝的影響[J];中華內(nèi)科雜志;2005年02期

7 俞燕;;家禽注射西尼羅河病毒包膜蛋白可產(chǎn)生免疫保護(hù)[J];中國家禽;2010年07期

8 Pillai S.K;Pond S.L.K;張平;;腦脊液源性HIV-1包膜蛋白基因的遺傳特征[J];世界核心醫(yī)學(xué)期刊文摘(神經(jīng)病學(xué)分冊);2006年11期

9 張銘明;張銳;;抗核包膜蛋白在原發(fā)性膽汁性肝硬化中的研究進(jìn)展[J];國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志;2010年08期

10 史同瑞;用單抗阻斷ELISA檢測羊梅迪-維斯那病[J];畜牧獸醫(yī)科技信息;2001年08期

相關(guān)會議論文 前10條

1 劉鐳;李永哲;曾常茜;高揚(yáng);朱立平;;核包膜蛋白gp210自身抗原的重組及表達(dá)[A];首屆全國中青年風(fēng)濕病學(xué)學(xué)術(shù)大會論文匯編[C];2004年

2 陳坤;張賀秋;王國華;宋曉國;于繼云;邱艷;朱翠俠;凌世淦;;SARS病毒不同基因區(qū)抗原與SARS患者血清反應(yīng)性的研究[A];第6次全國微生物學(xué)與免疫學(xué)大會論文摘要匯編[C];2004年

3 孫永濤;莊嚴(yán);;HIV-1感染與CTL應(yīng)答研究進(jìn)展[A];中華醫(yī)學(xué)會第四次全國艾滋病、病毒性丙型肝炎暨全國熱帶病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2009年

4 許剛;關(guān)默;趙平;王文;任浩;戚中田;;SR-B1基因多態(tài)性對HCV感染性的影響[A];第三屆中國臨床微生物學(xué)大會暨微生物學(xué)與免疫學(xué)論壇論文匯編[C];2012年

5 陳新月;;乙型肝炎治療性疫苗研究進(jìn)展[A];第一屆全國疑難重型肝病大會、第四屆全國人工肝及血液凈化學(xué)術(shù)年會論文集[C];2008年

6 李永哲;佟大偉;張蜀瀾;于孟學(xué);張奉春;高揚(yáng);朱立平;劉鐳;孫慶國;孫慶國;趙振國;;核包膜蛋白gp210 p62和LBR自身抗原基因克隆表達(dá)及其抗體在原發(fā)性膽汁性肝硬化中的診斷價值初探[A];第十屆全國風(fēng)濕病學(xué)學(xué)術(shù)會議論文集[C];2005年

7 謝小燕;郭慶;程通;李少偉;張軍;夏寧邵;;不同區(qū)段HIV-1 env基因在Bac-to-Bac昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)及檢測[A];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)會第八屆會員代表大會暨全國學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2001年

8 周躍鋼;;病毒感染的初期過程:與細(xì)胞表面組分的相互作用[A];重慶市生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2009年

9 唐紅;陳蘭蘭;陳恩強(qiáng);劉翠平;白浪;程星;劉聰;;乙型肝炎病毒逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)A181T和M204I基因耐藥突變所致其S區(qū)包膜蛋白羧基端發(fā)生的截短和替換突變株生物學(xué)特性研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第十三次全國感染病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2014年

10 劉興龍;葉賢苗;蘇婉;陳凌;馮立強(qiáng);;寨卡病毒疫苗研究[A];2018新發(fā)傳染病研究熱點(diǎn)研討會論文集[C];2018年

相關(guān)重要報紙文章 前1條

1 記者 衣曉峰;HIV主流亞型致病“與眾不同”[N];健康報;2019年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 彭浩然;HCV包膜蛋白適應(yīng)性突變對其感染特性和抗體中和活性的影響[D];中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué);2018年

2 張明順;中國HIV-1包膜蛋白中和免疫原性研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2011年

3 李煈鵬;HIV-1包膜蛋白gp120在進(jìn)化中的選擇及V1區(qū)功能研究[D];中國科學(xué)院研究生院(武漢病毒研究所);2016年

4 劉沐桑;HIV-1 V2區(qū)突變對抗V3區(qū)單克隆抗體逃逸的影響[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2011年

5 陳飛;人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒W(wǎng)家族、R家族編碼蛋白在人體組織和腫瘤組織中表達(dá)研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2013年

6 王文博;HCV E2半胱氨酸突變對其結(jié)構(gòu)和功能的影響及慢性丙肝患者體內(nèi)中和抗體研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2014年

7 王于;基于扎伊爾埃博拉病毒包膜蛋白的新抗原片段篩選及rVSV載體疫苗的構(gòu)建[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2014年

8 張瑞濤;靶向HIV和AIV包膜蛋白跨膜亞基的病毒進(jìn)入抑制劑研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2009年

9 張璐;基于DNA疫苗技術(shù)的病毒保護(hù)性抗體研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2014年

10 劉媛;高變區(qū)1抑制丙型肝炎病毒包膜蛋白E2誘生交叉中和抗體[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 俞維維;發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒基因組及其包膜蛋白Gn-Gc的研究[D];浙江中醫(yī)藥大學(xué);2019年

2 楊超;人類免疫缺陷病毒1型包膜蛋白gp140在哺乳動物細(xì)胞中的高效表達(dá)、性質(zhì)鑒定及中和單抗的篩選[D];廈門大學(xué);2017年

3 朱天川;一種低成本、快速診斷人類登革熱病毒感染的肽化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法（CLEIA）的建立[D];南方醫(yī)科大學(xué);2018年

4 李玉斌;SARS小包膜蛋白表達(dá)、純化及單克隆抗體的制備[D];吉林大學(xué);2006年

5 李甜;北京市MSM人群HIV-1流行亞型包膜蛋白基因全長擴(kuò)增方法研究[D];首都醫(yī)科大學(xué);2013年

6 薛添;漢灘病毒重組假病毒的構(gòu)建及包膜蛋白糖基化對病毒免疫學(xué)性狀影響的初步研究[D];西北大學(xué);2015年

7 盧莎;嵌合1a與1b亞型包膜蛋白基因HCV細(xì)胞培養(yǎng)模型的初步研究[D];內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院;2009年

8 孫后超;西尼羅病毒E蛋白Ⅲ區(qū)的原核表達(dá)及其對西尼羅病毒感染的免疫保護(hù)作用[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2010年

9 聶建輝;HIV-1膜抗原改造及免疫原性評價[D];中國藥品生物制品檢定所;2007年

10 王玉霞;HIV-1包膜蛋白gp41胞外近膜區(qū)域的結(jié)構(gòu)研究[D];吉林大學(xué);2011年

，

本文編號：2637211