【摘要】：結核病(TB)是威脅人類健康的重要傳染病。2018年全球結核病報告顯示2017年全球范圍內估算有1000萬結核病新發(fā)病例,約有160萬例患者死亡;與此同時,耐藥結核病仍然是嚴重危害公共健康的疾病,2017年全球估算新發(fā)利福平耐藥結核病(Resistant to Rifampicin,RR-TB)患者55.8萬例(48.3-63.9萬),其中82%為耐多藥結核病(Multidrug-Resistant TB,MDR-TB)。而在MDR-TB患者中,估算8.5%為廣泛耐藥結核病(Extensivelydrug-resistant TB,XDR-TB)。因此,了解結核分枝桿菌的耐藥機制,尋找參與耐藥的相關基因,進而開發(fā)抗結核病新藥物對于提高耐多藥/廣泛耐藥結核病的治療效果顯得尤為重要。而目前,對于結核分枝桿菌生物學等基礎研究的發(fā)展較為緩慢,一方面是結核分枝桿菌代時較長,約為24小時;另一方面受限于缺乏有效的遺傳操作系統(tǒng)構建基因敲除突變株和點突變株,獲得一個完全突變株的時間大概需要至少半年以上,這嚴重制約了對于結核分枝桿菌生物學研究。雖然現已有許多基因操作工具成功應用于分枝桿菌中,但都存在著容易使細菌生長受限、構建過程繁瑣耗時長以及重組效率低等諸多缺點。CRISPR-Cas系統(tǒng),包括CRISPR-Cas9系統(tǒng)和CRISPR-Cas12a(Cpf1)系統(tǒng),具有精確識別及剪切特異性DNA序列的功能而被開發(fā)成一種高效便捷的基因編輯工具。在應用中,CRISPR系統(tǒng)可在特定靶點形成DNA雙鏈斷裂,繼而誘導同源重組(HR)或非同源末端連接修復(NHEJ),為基因組定向改造與調控帶來了革命性的突破。本論文旨在以CRISPR-Cas系統(tǒng)為基礎開發(fā)適用于結核分枝桿菌的基因組編輯工具。論文第一部分將CRISPR-Cas系統(tǒng),尤其是CRISPR-Cas12a系統(tǒng)與同源重組系統(tǒng)配合使用,即在重組的過程中,構建靶向crRNA引導Cas12a核酸酶對靶點進行剪切產生雙鏈斷裂,則可對未發(fā)生重組的進行淘汰,從而篩選出發(fā)生重組的突變體。首先驗證了 CRISPR-Cas12a在恥垢分枝桿菌中具有剪切活性;然后結合同源重組,驗證了利用單鏈DNA寡核苷酸可以有效地進行點突變、刪除及插入,隨后證實可以雙鏈DNA進行無標簽的刪除與替換。綜上所述CRISPR-Cas系統(tǒng)輔助的同源重組技術在恥垢分枝桿菌中能夠快速高效地進行多種基因無標簽和無痕突變。本論文的第二部分用CRISPR-Cas系統(tǒng)聯合NHEJ,實現了在結核分枝桿菌中進行一步法刪除基因。首先將第一部分CRISPR-Cas系統(tǒng)輔助的同源重組技術運用到了海分枝桿菌中,結果并沒有發(fā)生預期的同源重組而是發(fā)生了非同源末端連接的修復。為了進一步推廣該系統(tǒng)在其他分枝桿菌中的應用,我們通過三個步驟來增加NHEJ的活性:1)高表達NHEJ元件增加NHEJ修復效率;2)抑制RecA介導的HR,進而增加NHEJ修復效率;3)通過誘導啟動表達使CRISPR-Cas介導的DSB斷裂發(fā)生在菌體生長的穩(wěn)定期。我們構建了一系列的基因組編輯系統(tǒng),其中恥垢分枝桿菌需要兩步,結核分枝桿菌需要三步才能實現高效的CRISPR-Cas介導的NHEJ進行基因組編輯。與此同時,我們還利用該系統(tǒng)在結核分枝桿菌中實現了精確刪除以及同時引入多重突變,實現對結核分枝桿菌基因的高效、快速的遺傳操作。此外,鑒于該系統(tǒng)的高效性,可以將該系統(tǒng)用于構建突變子庫進行高通量篩選,為深入研究結核分枝桿菌基因的功能,進而了解結核分枝桿菌耐藥相關機制提供可靠的技術支持。
【圖文】：

邐中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院邐博士學位論文邐逡逑ＣＲＩＳＰＲ防御的過程主要包括３個階段：適應、表達和干擾［１２］。在適應階段，逡逑ＣＲＩＳＰＲ系統(tǒng)會將一段與質�；蜞途w上基因片段（原間隔序歹丨』，ｐｒｏｔｏ－ｓｐａｃｅｒｓ）逡逑同源的短片段ＤＮＡ插入到前導序列與第一段重復序列之間，每一次插入活動都伴逡逑隨著重復序列的復制，進而形成一個新的重復序列（Ｒｅｐｅａｔｓ）－間隔序列（Ｓｐａｃｅｒｓ）逡逑單元，這樣使得ＣＲＩＳＰＲ基因座中存在著此種質�；蚴删w的序列信息，為適應性逡逑免疫奠定了結構基礎。在表達階段，ＣＲＩＳＰＲ基因座會被轉錄成一段長鏈的逡逑ＣＲＩＳＰＲ邋ＲＮＡ邋（ｃｒＲＮＡ）前體（ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ），該前體將會在重復序歹ｉｊ處被剪切，而逡逑后被Ｃａｓ內切酶加工成成熟的ｃｒＲＮＡ。成熟的ｃｒＲＮＡ將會與Ｃａｓ蛋白結合形成逡逑Ｃａｓ／ｃｒＲＮＡ效應復合體，在干擾階段發(fā)揮作用。在千擾階段，ｃｒＲＮＡ作為復合體逡逑的向導，協(xié)助其尋找與其同源的外源核酸靶標，當ｃｒＲＮＡ與原間隔序列互補配對逡逑完成時，，Ｃａｓ核酸酶會對ＤＮＡ進行切割從而對靶標進行降解。逡逑．．．．邋邐

中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院邐博士學位論文擾。Ｃｌａｓｓ邋１類ＣＲＩＳＰＲ系統(tǒng)中又包括Ｉ型和ＩＩＩ型兩大亞型；Ｃｌａｓｓ邋２類ＣＲＩＳＰＲ中包括與以Ｃａｓ９家族為效應蛋白的ＩＩ型，２０１５年發(fā)現的Ｖ型，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓｌ２５］以及作用于ＲＮＡ的ＶＩ型，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓｌ３ａ［１６］。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系統(tǒng)包含一個單一功能Ｃａｓ９和兩個非編碼ＲＮＡ，即ｃｒＲＮＡ和反式激活ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）邋［１７］。逡逑Ｃａｓ９系統(tǒng)相比，Ｃａｓｌ２ａ有三點不同：一、Ｃａｓｌ２ａ相關的間隔重復序列轉錄剪成熟的ｃｒＲＮＡ不需要與ｔｒａｃｃｒＲＮＡ結合后再引導Ｃａｓｌ２ａ蛋白對靶標ＤＮＡ進切；二、Ｃａｓｌ２ａ－ｃｒＲＮＡ復合物識別的是一段富含胸腺嘧啶核苷的ＰＡＭ（Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ邋Ａｄｊａｃｅｎｔ邋Ｍｏｔｉｆ）；而Ｃａｓ９系統(tǒng)識別的是富含鳥Vt呤核苷的ＰＡＭ區(qū)；逡逑、Ｃａｓｌ２ａ－ｃｒＲＮＡ復合物剪切ＤＮＡ靶標產生的是一個含有４或５個粘性末端的斷裂，而Ｃａｓ９－ＣｒＲＮＡ介導的ＤＮＡ斷裂為平末端［１５’邋１８’邋１９］。逡逑
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q78;R378.911

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