【摘要】：結(jié)核病(TB)是威脅人類健康的重要傳染病。2018年全球結(jié)核病報(bào)告顯示2017年全球范圍內(nèi)估算有1000萬結(jié)核病新發(fā)病例,約有160萬例患者死亡;與此同時(shí),耐藥結(jié)核病仍然是嚴(yán)重危害公共健康的疾病,2017年全球估算新發(fā)利福平耐藥結(jié)核病(Resistant to Rifampicin,RR-TB)患者55.8萬例(48.3-63.9萬),其中82%為耐多藥結(jié)核病(Multidrug-Resistant TB,MDR-TB)。而在MDR-TB患者中,估算8.5%為廣泛耐藥結(jié)核病(Extensivelydrug-resistant TB,XDR-TB)。因此,了解結(jié)核分枝桿菌的耐藥機(jī)制,尋找參與耐藥的相關(guān)基因,進(jìn)而開發(fā)抗結(jié)核病新藥物對于提高耐多藥/廣泛耐藥結(jié)核病的治療效果顯得尤為重要。而目前,對于結(jié)核分枝桿菌生物學(xué)等基礎(chǔ)研究的發(fā)展較為緩慢,一方面是結(jié)核分枝桿菌代時(shí)較長,約為24小時(shí);另一方面受限于缺乏有效的遺傳操作系統(tǒng)構(gòu)建基因敲除突變株和點(diǎn)突變株,獲得一個(gè)完全突變株的時(shí)間大概需要至少半年以上,這嚴(yán)重制約了對于結(jié)核分枝桿菌生物學(xué)研究。雖然現(xiàn)已有許多基因操作工具成功應(yīng)用于分枝桿菌中,但都存在著容易使細(xì)菌生長受限、構(gòu)建過程繁瑣耗時(shí)長以及重組效率低等諸多缺點(diǎn)。CRISPR-Cas系統(tǒng),包括CRISPR-Cas9系統(tǒng)和CRISPR-Cas12a(Cpf1)系統(tǒng),具有精確識別及剪切特異性DNA序列的功能而被開發(fā)成一種高效便捷的基因編輯工具。在應(yīng)用中,CRISPR系統(tǒng)可在特定靶點(diǎn)形成DNA雙鏈斷裂,繼而誘導(dǎo)同源重組(HR)或非同源末端連接修復(fù)(NHEJ),為基因組定向改造與調(diào)控帶來了革命性的突破。本論文旨在以CRISPR-Cas系統(tǒng)為基礎(chǔ)開發(fā)適用于結(jié)核分枝桿菌的基因組編輯工具。論文第一部分將CRISPR-Cas系統(tǒng),尤其是CRISPR-Cas12a系統(tǒng)與同源重組系統(tǒng)配合使用,即在重組的過程中,構(gòu)建靶向crRNA引導(dǎo)Cas12a核酸酶對靶點(diǎn)進(jìn)行剪切產(chǎn)生雙鏈斷裂,則可對未發(fā)生重組的進(jìn)行淘汰,從而篩選出發(fā)生重組的突變體。首先驗(yàn)證了 CRISPR-Cas12a在恥垢分枝桿菌中具有剪切活性;然后結(jié)合同源重組,驗(yàn)證了利用單鏈DNA寡核苷酸可以有效地進(jìn)行點(diǎn)突變、刪除及插入,隨后證實(shí)可以雙鏈DNA進(jìn)行無標(biāo)簽的刪除與替換。綜上所述CRISPR-Cas系統(tǒng)輔助的同源重組技術(shù)在恥垢分枝桿菌中能夠快速高效地進(jìn)行多種基因無標(biāo)簽和無痕突變。本論文的第二部分用CRISPR-Cas系統(tǒng)聯(lián)合NHEJ,實(shí)現(xiàn)了在結(jié)核分枝桿菌中進(jìn)行一步法刪除基因。首先將第一部分CRISPR-Cas系統(tǒng)輔助的同源重組技術(shù)運(yùn)用到了海分枝桿菌中,結(jié)果并沒有發(fā)生預(yù)期的同源重組而是發(fā)生了非同源末端連接的修復(fù)。為了進(jìn)一步推廣該系統(tǒng)在其他分枝桿菌中的應(yīng)用,我們通過三個(gè)步驟來增加NHEJ的活性:1)高表達(dá)NHEJ元件增加NHEJ修復(fù)效率;2)抑制RecA介導(dǎo)的HR,進(jìn)而增加NHEJ修復(fù)效率;3)通過誘導(dǎo)啟動表達(dá)使CRISPR-Cas介導(dǎo)的DSB斷裂發(fā)生在菌體生長的穩(wěn)定期。我們構(gòu)建了一系列的基因組編輯系統(tǒng),其中恥垢分枝桿菌需要兩步,結(jié)核分枝桿菌需要三步才能實(shí)現(xiàn)高效的CRISPR-Cas介導(dǎo)的NHEJ進(jìn)行基因組編輯。與此同時(shí),我們還利用該系統(tǒng)在結(jié)核分枝桿菌中實(shí)現(xiàn)了精確刪除以及同時(shí)引入多重突變,實(shí)現(xiàn)對結(jié)核分枝桿菌基因的高效、快速的遺傳操作。此外,鑒于該系統(tǒng)的高效性,可以將該系統(tǒng)用于構(gòu)建突變子庫進(jìn)行高通量篩選,為深入研究結(jié)核分枝桿菌基因的功能,進(jìn)而了解結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)機(jī)制提供可靠的技術(shù)支持。
【圖文】：

邐中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院邐博士學(xué)位論文邐逡逑ＣＲＩＳＰＲ防御的過程主要包括３個(gè)階段：適應(yīng)、表達(dá)和干擾［１２］。在適應(yīng)階段，逡逑ＣＲＩＳＰＲ系統(tǒng)會將一段與質(zhì)�；蜞途w上基因片段（原間隔序歹丨』，ｐｒｏｔｏ－ｓｐａｃｅｒｓ）逡逑同源的短片段ＤＮＡ插入到前導(dǎo)序列與第一段重復(fù)序列之間，每一次插入活動都伴逡逑隨著重復(fù)序列的復(fù)制，進(jìn)而形成一個(gè)新的重復(fù)序列（Ｒｅｐｅａｔｓ）－間隔序列（Ｓｐａｃｅｒｓ）逡逑單元，這樣使得ＣＲＩＳＰＲ基因座中存在著此種質(zhì)粒或噬菌體的序列信息，為適應(yīng)性逡逑免疫奠定了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。在表達(dá)階段，ＣＲＩＳＰＲ基因座會被轉(zhuǎn)錄成一段長鏈的逡逑ＣＲＩＳＰＲ邋ＲＮＡ邋（ｃｒＲＮＡ）前體（ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ），該前體將會在重復(fù)序歹ｉｊ處被剪切，而逡逑后被Ｃａｓ內(nèi)切酶加工成成熟的ｃｒＲＮＡ。成熟的ｃｒＲＮＡ將會與Ｃａｓ蛋白結(jié)合形成逡逑Ｃａｓ／ｃｒＲＮＡ效應(yīng)復(fù)合體，在干擾階段發(fā)揮作用。在千擾階段，ｃｒＲＮＡ作為復(fù)合體逡逑的向?qū)В瑓f(xié)助其尋找與其同源的外源核酸靶標(biāo)，當(dāng)ｃｒＲＮＡ與原間隔序列互補(bǔ)配對逡逑完成時(shí)，，Ｃａｓ核酸酶會對ＤＮＡ進(jìn)行切割從而對靶標(biāo)進(jìn)行降解。逡逑．．．．邋邐

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院邐博士學(xué)位論文擾。Ｃｌａｓｓ邋１類ＣＲＩＳＰＲ系統(tǒng)中又包括Ｉ型和ＩＩＩ型兩大亞型；Ｃｌａｓｓ邋２類ＣＲＩＳＰＲ中包括與以Ｃａｓ９家族為效應(yīng)蛋白的ＩＩ型，２０１５年發(fā)現(xiàn)的Ｖ型，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓｌ２５］以及作用于ＲＮＡ的ＶＩ型，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓｌ３ａ［１６］。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系統(tǒng)包含一個(gè)單一功能Ｃａｓ９和兩個(gè)非編碼ＲＮＡ，即ｃｒＲＮＡ和反式激活ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）邋［１７］。逡逑Ｃａｓ９系統(tǒng)相比，Ｃａｓｌ２ａ有三點(diǎn)不同：一、Ｃａｓｌ２ａ相關(guān)的間隔重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄剪成熟的ｃｒＲＮＡ不需要與ｔｒａｃｃｒＲＮＡ結(jié)合后再引導(dǎo)Ｃａｓｌ２ａ蛋白對靶標(biāo)ＤＮＡ進(jìn)切；二、Ｃａｓｌ２ａ－ｃｒＲＮＡ復(fù)合物識別的是一段富含胸腺嘧啶核苷的ＰＡＭ（Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ邋Ａｄｊａｃｅｎｔ邋Ｍｏｔｉｆ）；而Ｃａｓ９系統(tǒng)識別的是富含鳥Vt呤核苷的ＰＡＭ區(qū)；逡逑、Ｃａｓｌ２ａ－ｃｒＲＮＡ復(fù)合物剪切ＤＮＡ靶標(biāo)產(chǎn)生的是一個(gè)含有４或５個(gè)粘性末端的斷裂，而Ｃａｓ９－ＣｒＲＮＡ介導(dǎo)的ＤＮＡ斷裂為平末端［１５’邋１８’邋１９］。逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q78;R378.911

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本文編號：2636559