【摘要】：寨卡病毒與登革病毒、黃熱病毒、乙型腦炎病毒、西尼羅病毒等同為黃病毒科黃病毒屬重要成員,是引起寨卡病毒病的病原體,主要流行于非洲、美洲、亞洲和太平洋地區(qū)。寨卡病毒是單股正鏈RNA病毒,其基因組長約11 kb,包括3個結構蛋白(C,prM/M和E)和7個非結構蛋白(NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5)。其中,包膜E蛋白主要負責行使受體結合及膜融合等重要功能,也是誘導產(chǎn)生保護性抗體的主要抗原。E蛋白主要由結構域Ⅰ(DomainⅠ,DⅠ),Ⅱ和Ⅲ組成。DⅠ連接DⅡ和DⅢ。DⅡ的融合環(huán)在膜融合期間與宿主相互作用,DⅢ含有特定的受體結合位點,在膜融合中有重要作用。與其他黃病毒相比,寨卡病毒E蛋白DⅠ的糖環(huán)含有從胞膜表面突出的單個糖基化位點,且包含一個較長的150環(huán)狀區(qū)域。黃病毒的E蛋白的糖環(huán)區(qū)很不保守,即使在寨卡病毒的不同株中也存在不同,可能影響寨卡病毒等黃病毒的傳播和致病性。寨卡病毒在進化過程中會獲得一些適應性突變,導致感染力和傳播能力顯著增強,很可能是導致此次寨卡病毒世界大流行和數(shù)以千計的新生兒小頭癥的主要原因。我們通過序列分析發(fā)現(xiàn),寨卡病毒非洲株在E蛋白糖環(huán)區(qū)存在不同氨基酸序列的缺失;同時,如果糖環(huán)缺失也是寨卡病毒的適應性突變,那么其對寨卡病毒生物學效應的影響及具體作用機制也是亟需闡明的科學問題。針對上述問題,我們首先應用生物信息學方法系統(tǒng)比較了E蛋白糖環(huán)缺失在全球寨卡病毒分離株中的分布情況,對其進化地位進行了分析;然后運用反向遺傳學技術將該氨基酸序列缺失引入到寨卡病毒亞洲株的感染性克隆中,拯救獲得了糖環(huán)缺失突變病毒;通過一系列體內(nèi)外生物學功能鑒定,明確糖環(huán)缺失對寨卡病毒生物學功能的影響;最后通過分析糖環(huán)缺失突變體的結構明確其可能的作用機制。本研究主要包括兩個部分:一、寨卡病毒糖環(huán)缺失突變體全長感染性克隆的構建與鑒定首先,為確認E蛋白糖環(huán)區(qū)域缺失的非洲株和亞洲株及相應的缺失序列,我們對寨卡病毒的基因組序列進行比對并建立了系統(tǒng)發(fā)生樹。結果表明,寨卡病毒不同進化分支中均存在4至7個氨基酸的糖環(huán)缺失,尤其是新近分離的亞洲流行株中突然出現(xiàn)糖環(huán)缺失突變株,表明糖環(huán)缺失可能在寨卡病毒的進化中具有重要作用。然后,為了獲得E蛋白糖環(huán)缺失的重組寨卡病毒并對其基本的生物學特征進行評價,我們運用反向遺傳學技術將該氨基酸序列缺失引入到寨卡病毒FSS13025全長感染性克隆,構建并獲得了E蛋白糖環(huán)缺失突變病毒。然后通過間接免疫熒光發(fā)現(xiàn)糖環(huán)缺失不影響寨卡病毒E蛋白的表達;增殖曲線分析顯示糖環(huán)缺失沒有改變寨卡病毒的復制能力;蝕斑實驗確定了糖環(huán)缺失重組寨卡病毒的蝕斑形態(tài)沒有發(fā)生變化;最后,通過糖基化實驗發(fā)現(xiàn)糖環(huán)缺失導致寨卡病毒E蛋白不能進行糖基化修飾。我們的結果表明,糖環(huán)缺失在一定程度上影響了寨卡病毒的生物學特征。二、糖環(huán)缺失重組寨卡病毒的感染和致病能力評價為了明確糖環(huán)缺失重組寨卡病毒的感染和致病能力,我們采用不同的小鼠模型測定了突變病毒的神經(jīng)毒力和神經(jīng)侵襲力,利用蚊模型檢測了突變病毒的感染力。結果發(fā)現(xiàn),糖環(huán)缺失增強了寨卡病毒對乳鼠的神經(jīng)毒力,并導致乳鼠出現(xiàn)更嚴重的小頭癥。而在A129和BALB/c成年小鼠模型上的致病性則明顯降低。此外,糖環(huán)缺失還降低了寨卡病毒的經(jīng)口感染能力,但對病毒通過蚊子中腸屏障的能力沒有影響。最后,通過對重組寨卡病毒E蛋白的結構特征進行分析發(fā)現(xiàn),糖環(huán)缺失引起寨卡病毒發(fā)生“乙型腦炎病毒樣”構象變化,包括不尋常的“洞”和糖環(huán)的拓撲結構的顯著變化,可能增強寨卡病毒與神經(jīng)細胞上特定受體的結合。綜上,本研究發(fā)現(xiàn)寨卡病毒E蛋白糖環(huán)特定氨基酸序列的缺失不僅在寨卡病毒非洲世系中存在,并且出現(xiàn)在當前流行的亞洲世系中,在寨卡病毒的適應性進化中可能有重要作用。此外,糖環(huán)缺失導致寨卡病毒在成年小鼠中的神經(jīng)侵襲力和蚊蟲中的感染力減弱;但增強其在乳鼠上的神經(jīng)毒力及造成更嚴重的小頭畸形,可能與糖環(huán)缺失導致寨卡病毒E蛋白結構發(fā)生“乙型腦炎病毒樣”變化相關。我們的研究結果加深了對寨卡病毒致病機制的理解,同時,糖環(huán)缺失突變可作為寨卡病毒神經(jīng)毒力監(jiān)測的生物標志,因而有必要對糖環(huán)缺失的再現(xiàn)進行長期持續(xù)的監(jiān)測。
【圖文】：

2.2 方法2.2.1 系統(tǒng)發(fā)育分析從 Genbank 獲取寨卡病毒全長基因組序列，，利用 MEGA7 對基因組進行核苷酸序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析。生物系統(tǒng)發(fā)生樹采用最大似然法計算，核苷酸替代模型采用 GTR+G+I，循環(huán)次數(shù)執(zhí)行 1000 次。2.2.2 克隆的構建為構建含有 E 蛋白糖環(huán)缺失的寨卡病毒突變體質(zhì)粒，首先采用融合 PCR 的方法獲得帶有突變位點的 DNA 片段。然后利用 AvrII/NotI 雙酶切體系將帶有突變位點的 DNA 片段切下，與同樣雙酶切的寨卡病毒（FSS13025）全長感染性克隆質(zhì)粒連接，從而獲得含有糖環(huán)缺失的寨卡病毒突變體質(zhì)粒。構建的突變質(zhì)粒分別包括 E蛋白糖環(huán)內(nèi)缺失 4 個和 6 個氨基酸序列。突變質(zhì)粒的構建示意圖如圖 1-1 所示。融合 PCR 引物序列如表 1-2 所示。

圖 1-2 寨卡病毒的亞洲和非洲世系中均存在糖環(huán)缺失 1-2 Glycan loop deletions are present in both Asian and African lineages of Z缺失寨卡病毒的系統(tǒng)發(fā)育分析 MEGA7 采用最大似然法建立生物系統(tǒng)發(fā)生樹，核苷酸替代I，E 蛋白存在糖環(huán)缺失的非洲株和亞洲株分別用黃色和綠色突系統(tǒng)進化樹上可以看出，寨卡病毒分為非洲和亞洲兩個世系，其分為兩個亞支，即亞洲本土株和美洲及太平洋流行株。從圖中環(huán)缺失株主要分布在寨卡病毒非洲世系，在 1947 年，1963 年 1997 年共分離到 10 株含有糖環(huán)缺失的寨卡病毒株（其中一株組序列，其余 9 株含有寨卡病毒全長基因組序列），含有糖環(huán)缺分散在非洲世系的不同進化分支中，說明糖環(huán)缺失的獨立出現(xiàn) 月從韓國分離的兩株寨卡病毒株在 E 蛋白糖環(huán)區(qū)域存在氨基酸
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R373

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