發(fā)布時(shí)間：2020-04-19 05:13

【摘要】：寨卡病毒與登革病毒、黃熱病毒、乙型腦炎病毒、西尼羅病毒等同為黃病毒科黃病毒屬重要成員,是引起寨卡病毒病的病原體,主要流行于非洲、美洲、亞洲和太平洋地區(qū)。寨卡病毒是單股正鏈RNA病毒,其基因組長(zhǎng)約11 kb,包括3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(C,prM/M和E)和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5)。其中,包膜E蛋白主要負(fù)責(zé)行使受體結(jié)合及膜融合等重要功能,也是誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性抗體的主要抗原。E蛋白主要由結(jié)構(gòu)域Ⅰ(DomainⅠ,DⅠ),Ⅱ和Ⅲ組成。DⅠ連接DⅡ和DⅢ。DⅡ的融合環(huán)在膜融合期間與宿主相互作用,DⅢ含有特定的受體結(jié)合位點(diǎn),在膜融合中有重要作用。與其他黃病毒相比,寨卡病毒E蛋白DⅠ的糖環(huán)含有從胞膜表面突出的單個(gè)糖基化位點(diǎn),且包含一個(gè)較長(zhǎng)的150環(huán)狀區(qū)域。黃病毒的E蛋白的糖環(huán)區(qū)很不保守,即使在寨卡病毒的不同株中也存在不同,可能影響寨卡病毒等黃病毒的傳播和致病性。寨卡病毒在進(jìn)化過(guò)程中會(huì)獲得一些適應(yīng)性突變,導(dǎo)致感染力和傳播能力顯著增強(qiáng),很可能是導(dǎo)致此次寨卡病毒世界大流行和數(shù)以千計(jì)的新生兒小頭癥的主要原因。我們通過(guò)序列分析發(fā)現(xiàn),寨卡病毒非洲株在E蛋白糖環(huán)區(qū)存在不同氨基酸序列的缺失;同時(shí),如果糖環(huán)缺失也是寨卡病毒的適應(yīng)性突變,那么其對(duì)寨卡病毒生物學(xué)效應(yīng)的影響及具體作用機(jī)制也是亟需闡明的科學(xué)問(wèn)題。針對(duì)上述問(wèn)題,我們首先應(yīng)用生物信息學(xué)方法系統(tǒng)比較了E蛋白糖環(huán)缺失在全球寨卡病毒分離株中的分布情況,對(duì)其進(jìn)化地位進(jìn)行了分析;然后運(yùn)用反向遺傳學(xué)技術(shù)將該氨基酸序列缺失引入到寨卡病毒亞洲株的感染性克隆中,拯救獲得了糖環(huán)缺失突變病毒;通過(guò)一系列體內(nèi)外生物學(xué)功能鑒定,明確糖環(huán)缺失對(duì)寨卡病毒生物學(xué)功能的影響;最后通過(guò)分析糖環(huán)缺失突變體的結(jié)構(gòu)明確其可能的作用機(jī)制。本研究主要包括兩個(gè)部分:一、寨卡病毒糖環(huán)缺失突變體全長(zhǎng)感染性克隆的構(gòu)建與鑒定首先,為確認(rèn)E蛋白糖環(huán)區(qū)域缺失的非洲株和亞洲株及相應(yīng)的缺失序列,我們對(duì)寨卡病毒的基因組序列進(jìn)行比對(duì)并建立了系統(tǒng)發(fā)生樹。結(jié)果表明,寨卡病毒不同進(jìn)化分支中均存在4至7個(gè)氨基酸的糖環(huán)缺失,尤其是新近分離的亞洲流行株中突然出現(xiàn)糖環(huán)缺失突變株,表明糖環(huán)缺失可能在寨卡病毒的進(jìn)化中具有重要作用。然后,為了獲得E蛋白糖環(huán)缺失的重組寨卡病毒并對(duì)其基本的生物學(xué)特征進(jìn)行評(píng)價(jià),我們運(yùn)用反向遺傳學(xué)技術(shù)將該氨基酸序列缺失引入到寨卡病毒FSS13025全長(zhǎng)感染性克隆,構(gòu)建并獲得了E蛋白糖環(huán)缺失突變病毒。然后通過(guò)間接免疫熒光發(fā)現(xiàn)糖環(huán)缺失不影響寨卡病毒E蛋白的表達(dá);增殖曲線分析顯示糖環(huán)缺失沒(méi)有改變寨卡病毒的復(fù)制能力;蝕斑實(shí)驗(yàn)確定了糖環(huán)缺失重組寨卡病毒的蝕斑形態(tài)沒(méi)有發(fā)生變化;最后,通過(guò)糖基化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)糖環(huán)缺失導(dǎo)致寨卡病毒E蛋白不能進(jìn)行糖基化修飾。我們的結(jié)果表明,糖環(huán)缺失在一定程度上影響了寨卡病毒的生物學(xué)特征。二、糖環(huán)缺失重組寨卡病毒的感染和致病能力評(píng)價(jià)為了明確糖環(huán)缺失重組寨卡病毒的感染和致病能力,我們采用不同的小鼠模型測(cè)定了突變病毒的神經(jīng)毒力和神經(jīng)侵襲力,利用蚊模型檢測(cè)了突變病毒的感染力。結(jié)果發(fā)現(xiàn),糖環(huán)缺失增強(qiáng)了寨卡病毒對(duì)乳鼠的神經(jīng)毒力,并導(dǎo)致乳鼠出現(xiàn)更嚴(yán)重的小頭癥。而在A129和BALB/c成年小鼠模型上的致病性則明顯降低。此外,糖環(huán)缺失還降低了寨卡病毒的經(jīng)口感染能力,但對(duì)病毒通過(guò)蚊子中腸屏障的能力沒(méi)有影響。最后,通過(guò)對(duì)重組寨卡病毒E蛋白的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),糖環(huán)缺失引起寨卡病毒發(fā)生“乙型腦炎病毒樣”構(gòu)象變化,包括不尋常的“洞”和糖環(huán)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的顯著變化,可能增強(qiáng)寨卡病毒與神經(jīng)細(xì)胞上特定受體的結(jié)合。綜上,本研究發(fā)現(xiàn)寨卡病毒E蛋白糖環(huán)特定氨基酸序列的缺失不僅在寨卡病毒非洲世系中存在,并且出現(xiàn)在當(dāng)前流行的亞洲世系中,在寨卡病毒的適應(yīng)性進(jìn)化中可能有重要作用。此外,糖環(huán)缺失導(dǎo)致寨卡病毒在成年小鼠中的神經(jīng)侵襲力和蚊蟲中的感染力減弱;但增強(qiáng)其在乳鼠上的神經(jīng)毒力及造成更嚴(yán)重的小頭畸形,可能與糖環(huán)缺失導(dǎo)致寨卡病毒E蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生“乙型腦炎病毒樣”變化相關(guān)。我們的研究結(jié)果加深了對(duì)寨卡病毒致病機(jī)制的理解,同時(shí),糖環(huán)缺失突變可作為寨卡病毒神經(jīng)毒力監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)志,因而有必要對(duì)糖環(huán)缺失的再現(xiàn)進(jìn)行長(zhǎng)期持續(xù)的監(jiān)測(cè)。
【圖文】：

2.2 方法2.2.1 系統(tǒng)發(fā)育分析從 Genbank 獲取寨卡病毒全長(zhǎng)基因組序列，，利用 MEGA7 對(duì)基因組進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析。生物系統(tǒng)發(fā)生樹采用最大似然法計(jì)算，核苷酸替代模型采用 GTR+G+I，循環(huán)次數(shù)執(zhí)行 1000 次。2.2.2 克隆的構(gòu)建為構(gòu)建含有 E 蛋白糖環(huán)缺失的寨卡病毒突變體質(zhì)粒，首先采用融合 PCR 的方法獲得帶有突變位點(diǎn)的 DNA 片段。然后利用 AvrII/NotI 雙酶切體系將帶有突變位點(diǎn)的 DNA 片段切下，與同樣雙酶切的寨卡病毒（FSS13025）全長(zhǎng)感染性克隆質(zhì)粒連接，從而獲得含有糖環(huán)缺失的寨卡病毒突變體質(zhì)粒。構(gòu)建的突變質(zhì)粒分別包括 E蛋白糖環(huán)內(nèi)缺失 4 個(gè)和 6 個(gè)氨基酸序列。突變質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖如圖 1-1 所示。融合 PCR 引物序列如表 1-2 所示。

圖 1-2 寨卡病毒的亞洲和非洲世系中均存在糖環(huán)缺失 1-2 Glycan loop deletions are present in both Asian and African lineages of Z缺失寨卡病毒的系統(tǒng)發(fā)育分析 MEGA7 采用最大似然法建立生物系統(tǒng)發(fā)生樹，核苷酸替代I，E 蛋白存在糖環(huán)缺失的非洲株和亞洲株分別用黃色和綠色突系統(tǒng)進(jìn)化樹上可以看出，寨卡病毒分為非洲和亞洲兩個(gè)世系，其分為兩個(gè)亞支，即亞洲本土株和美洲及太平洋流行株。從圖中環(huán)缺失株主要分布在寨卡病毒非洲世系，在 1947 年，1963 年 1997 年共分離到 10 株含有糖環(huán)缺失的寨卡病毒株（其中一株組序列，其余 9 株含有寨卡病毒全長(zhǎng)基因組序列），含有糖環(huán)缺分散在非洲世系的不同進(jìn)化分支中，說(shuō)明糖環(huán)缺失的獨(dú)立出現(xiàn) 月從韓國(guó)分離的兩株寨卡病毒株在 E 蛋白糖環(huán)區(qū)域存在氨基酸
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R373

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