【摘要】：反相蛋白質(zhì)陣列(Reverse-Phase Protein Array,RPPA)技術(shù)已經(jīng)成為強(qiáng)大、靈敏、成本有效、高通量的平臺(tái)技術(shù)方法,用于大量樣品的組織或細(xì)胞蛋白質(zhì)分析。通過與磷酸化抗體相結(jié)合手段,RPPA能同時(shí)測定總蛋白與磷酸化后修飾蛋白,代表了捕獲正常或患病細(xì)胞中信號通路及關(guān)鍵信號的絕佳方法。RPPA非常適用于生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)、臨床試驗(yàn)中活檢樣本的分析、藥效學(xué)評估、受腫瘤靶向治療影響的關(guān)鍵蛋白分析等領(lǐng)域,并正逐步發(fā)展為腫瘤分型、患者預(yù)后、合理藥物指導(dǎo)、個(gè)性化治療等臨床應(yīng)用的有力工具。目的:通過制備、鑒定與篩選可靠應(yīng)用于反相蛋白陣列的磷酸化抗體探針,建立細(xì)胞信號通路模型,以篩選的磷酸化抗體探針,利用RPPA技術(shù)探測細(xì)胞通路模型的信號,以便將該技術(shù)進(jìn)一步應(yīng)用于新藥開發(fā)、臨床樣本分析等領(lǐng)域。方法:制備Akt、MAPK、酪氨酸激酶(RTK)通路中關(guān)鍵激酶的磷酸化抗體,先通過常規(guī)免疫學(xué)方法對制備抗體進(jìn)行應(yīng)用驗(yàn)證;將應(yīng)用驗(yàn)證后抗體進(jìn)一步應(yīng)用于RPPA篩選,篩選出RPPA適用性與可靠性磷酸化抗體作為RPPA探針;使用LNCa P細(xì)胞,在4種方式(EGF,LY294,PMA,Na Cl)刺激下建立Akt、Erk/MAPK細(xì)胞信號通路模型;利用抗體探針與RPPA技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞信號通路模型分析。結(jié)果:該項(xiàng)目獲得53個(gè)通過免疫印跡(WB)、免疫組化(IHC)、免疫熒光(IF)應(yīng)用方法驗(yàn)證的磷酸化抗體;通過RPPA篩選獲得25個(gè)RPPA高適用性與可靠性抗體探針;將10個(gè)RPPA篩選的高質(zhì)量抗體探針應(yīng)用于Akt、MAPK信號通路模型分析,獲得4組LNCa P刺激模型的RPPA測試數(shù)據(jù)。4組模型結(jié)果均顯示了通路中關(guān)鍵信號分子響應(yīng)于4個(gè)外部擾動(dòng)的磷酸化狀態(tài)的動(dòng)態(tài)變化。RPPA結(jié)果數(shù)據(jù)與相應(yīng)的免疫印跡法(WB)分析結(jié)果一致,證實(shí)了分析數(shù)據(jù)的有效性與可靠性。結(jié)論:成功篩選出RPPA高適用性與可靠性磷酸化抗體探針,成功將抗體探針與RPPA結(jié)合應(yīng)用于細(xì)胞信號通路模型分析。表明所制備的抗體探針與RPPA技術(shù)平臺(tái)相結(jié)合,極適合于分析細(xì)胞信號通路模型。該方法能夠有效地拓展RPPA探針,使其成為新藥開發(fā)、臨床樣本分析等領(lǐng)域的先進(jìn)工具。
【圖文】：

蛋白質(zhì)陣列平臺(tái)類型（上圖為正相陣列，，下圖為反相陣列）

磷酸化抗體部分鑒定結(jié)果
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R392

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本文編號：2634091