【摘要】：[目的]分別檢測(cè)抗菌肽LL-37和衣原體質(zhì)粒編碼蛋白pGP3能否誘導(dǎo)人陰道上皮細(xì)胞MS74產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-6和IL-8,檢測(cè)pGP3與LL-37結(jié)合對(duì)MS74產(chǎn)生IL-6和IL-8過程的影響。分別檢測(cè)pGP3和LL-37能否誘導(dǎo)脂多糖無應(yīng)答的基因突變小鼠C3H/HeJ小鼠的骨髓來源中性粒細(xì)胞產(chǎn)生IL-6和IL-8,檢測(cè)pGP3與LL-37結(jié)合對(duì)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生IL-6和IL-8過程的影響。初步研究在體外衣原體質(zhì)粒編碼蛋白pGP3結(jié)合抗菌肽LL-37對(duì)炎癥反應(yīng)的影響。[方法](1)復(fù)蘇人陰道上皮細(xì)胞MS74,使用DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素配制細(xì)胞生長(zhǎng)液,體外培養(yǎng)細(xì)胞于24孔板,細(xì)胞密度1.5×10~5/ml。用pGP3和LL-37在37℃下于細(xì)胞培養(yǎng)基中共同孵育30分鐘得到pGP3/LL-37復(fù)合物。設(shè)置正常細(xì)胞組、LL-37干預(yù)組(12μmol/L)、pGP3干預(yù)組(12μmol/L)、pGP3/LL-37復(fù)合物干預(yù)組(12μmol/L)。于37℃、5%CO_2干預(yù)24小時(shí)。收集上清液,使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)IL-6和IL-8。(2)從脂多糖無應(yīng)答的TLR4基因突變小鼠C3H/HeJ小鼠的脛骨和股骨獲得無菌的骨髓細(xì)胞。使用小鼠骨髓中性粒細(xì)胞分離液試劑盒分離出中性粒細(xì)胞,將紅細(xì)胞溶解后,使用RPMI-1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素配制細(xì)胞生長(zhǎng)液,細(xì)胞在37℃、5%CO_2下培養(yǎng)于10cm培養(yǎng)皿。每3天收集未貼壁的細(xì)胞培養(yǎng)于新的培養(yǎng)基。將中性粒細(xì)胞接種于24孔板,細(xì)胞密度1×10~6/ml,設(shè)置正常細(xì)胞組、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)干預(yù)組(10ng/ml)、Pam3干預(yù)組(0.1μg/ml)、LL-37組干預(yù)(0.05μmol/L、0.25μmol/L、1.25μmol/L)、pGP3干預(yù)組(0.05μmol/L、0.25μmol/L、1.25μmol/L)、pGP3/LL-37復(fù)合物干預(yù)組(0.05μmol/L、0.25μmol/L、1.25μmol/L),于37℃、5%CO_2干預(yù)24小時(shí)。收集上清液,使用ELISA檢測(cè)IL-6和IL-8。(3)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)使用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。[結(jié)果]pGP3不能誘導(dǎo)人陰道上皮細(xì)胞MS74分泌IL-6和IL-8,LL-37可誘導(dǎo)MS74分泌細(xì)胞因子IL-6和IL-8,LL-37與pGP3結(jié)合形成復(fù)合物后其促炎癥活性被抑制(~(**)p0.01 wilcoxon秩和檢驗(yàn))。LL-37不能刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-6和IL-8,pGP3可刺激中性粒細(xì)胞分泌低水平的細(xì)胞因子IL-6和IL-8,pGP3與LL-37結(jié)合形成復(fù)合物后其促炎癥活性顯著上升(~(**)p0.01 Wilcoxon秩和檢驗(yàn))。[結(jié)論]pGP3與LL-37結(jié)合形成穩(wěn)定復(fù)合物會(huì)抑制LL-37的促炎癥活性,但pGP3同樣通過與LL-37形成復(fù)合物可提升其自身對(duì)骨髓來源中性粒細(xì)胞的促炎癥活性。因此可以認(rèn)為衣原體可能通過pGP3阻斷宿主生殖道上皮組織對(duì)其不利的炎癥反應(yīng)來幫助自身存活和繁殖,同時(shí),激活骨髓來源中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)來幫助其致病及播散,使炎癥持續(xù)發(fā)展直至出現(xiàn)輸卵管纖維化等后遺癥。
【圖文】：

凍存：用二甲基亞砜和胎牛血清按 1：9 的比例配置并選擇狀態(tài)良好的未用于實(shí)驗(yàn)的 MS74 細(xì)胞，棄掉細(xì)PBS 清洗。棄掉瓶中 PBS,加入 0.25%胰蛋白酶-EDT細(xì)胞松動(dòng)后棄掉瓶中液體，時(shí)間不可過長(zhǎng)以免損傷輕柔，加入提前預(yù)熱過的細(xì)胞生長(zhǎng)液 2ml，用移液槍單個(gè)細(xì)胞。轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至離心管，，1000rpm 離心 入 1ml 凍存液，用移液槍將細(xì)胞沉淀吹打混勻，使在 5×106/ml~1×107/ml，然后轉(zhuǎn)移至凍存管中并標(biāo)記慢凍速融原則，先將凍存管置于 4℃冰箱中 30 分鐘時(shí)，然后放置于-80℃低溫冰箱中過夜，最后轉(zhuǎn)移至圖 1 所示為密度 1.5×105/ml，倒置顯微鏡下觀察可均勻，胞漿豐富。

2 pGP3 可抑制 LL-37 刺激 MS74 細(xì)胞分泌 IL-6 和C.t 導(dǎo)致的泌尿生殖系統(tǒng)感染的發(fā)生率增速迅猛，D[1]。C.t 可引發(fā)無癥狀感染，也引發(fā)尿道炎、宮頸種疾病，嚴(yán)重時(shí)可并發(fā)異位妊娠和輸卵管炎導(dǎo)致的患者中 10%~20%可能發(fā)生輸卵管性不孕[2]。C.t 感用的抗生素不敏感，導(dǎo)致感染反復(fù)、遷延，嚴(yán)重影了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此防控沙眼衣原體感染是當(dāng)衣原體共有一個(gè)高度保守的編碼 8 個(gè)開放閱讀框我復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，名為 pORF1-8 或 pGP1-8[4]。其中體，于感染人類生殖道的晚期在細(xì)胞胞漿中大量累快速釋放胞漿中的 pGP3 到細(xì)胞外環(huán)境中，從而 p了高度的免疫原性[10,13]。據(jù) Tang L 等人的研究顯示
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R374

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本文編號(hào)：2631788