【摘要】：研究目的分析表皮葡萄球菌SE1457 VraSR生物信息學(xué)特點(diǎn),并原核表達(dá)表皮葡萄球菌SE1457反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白VraR,檢測(cè)表皮葡萄球菌SE1457 vraSR敲除突變株(ΔvraSR)的生物學(xué)表型,結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序初步探索VraSR在表皮葡萄球菌生物膜形成和藥物敏感性中的作用,為后續(xù)具體研究VraSR在表皮葡萄球菌生物膜形成中的分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ),這對(duì)臨床上有效預(yù)防和控制表皮葡萄球菌生物膜感染具有重要意義。研究方法1.從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株SERP62A(ATCC35984)基因組序列,設(shè)計(jì)引物,以表皮葡萄球菌SE1457基因組為模板,PCR擴(kuò)增vraSR基因片段(重復(fù)3次),測(cè)序獲得SE1457 vraSR基因序列,通過(guò)生物信息學(xué)分析常用軟件對(duì)SE1457 VraSR的基因序列特點(diǎn)、氨基酸特點(diǎn)、結(jié)構(gòu)域特點(diǎn)進(jìn)行分析。從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取其它細(xì)菌VraS/vraR類(lèi)似物的遺傳信息,包括金黃色葡萄球菌(S.aureus USA300、S.aureus Col、S.aureus Newman、S.aureus Mu50、S.aureus MW2)、枯草桿菌(Bacillus subtilis substr 168)、變異鏈球菌(Streptococcus mutans substr UA159)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis substr MG1363),利用Vector NTI和DNAMAN軟件對(duì)SE1457 VraS/vraR與其它細(xì)菌類(lèi)似物的核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析,以比較它們的同源性。2.表皮葡萄球菌SE1457 VraR蛋白的表達(dá):PCR擴(kuò)增表皮葡萄球菌SE1457vraR基因(630 bp),酶切后連入載體pET28a,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-vraR,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21。通過(guò)摸索不同表達(dá)溫度(37℃、28℃、22℃、16℃)和不同IPTG誘導(dǎo)劑濃度(0.5 mM、0.8 mM、1.0 mM、1.5 mM)對(duì)重組蛋白6His-VraR進(jìn)行表達(dá),以確定最佳表達(dá)條件。3.表皮葡萄球菌SE1457及其vraSR敲除突變株的生物學(xué)表型研究:分別采用紙片彌散法和試管稀釋法檢測(cè)了表皮葡萄球菌SE1457野生株和ΔvraSR突變株對(duì)常用抗生素(萬(wàn)古霉素、氨芐青霉素、青霉素G、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、左氧氟沙星)的藥物敏感性。微量平板法檢測(cè)表皮葡萄球菌SE1457及其vraSR敲除突變株6h、12h、24h和48h生物膜形成量(OD570)。4.轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析:表皮葡萄球菌SE1457野生株和ΔvraSR突變株經(jīng)1:200稀釋于TSB培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)6h后收集細(xì)菌,抽提RNA,經(jīng)鑒定后送公司測(cè)序(上海伯豪生物技術(shù)有限公司),每樣品3次重復(fù)。研究結(jié)果1.vraS基因(基因座位serp1423)含有1047 bp,編碼348個(gè)氨基酸,vraR基因(基因座位serp1422)含630 bp,編碼209個(gè)氨基酸,兩者間有11 bp重復(fù)序列;vraSR上游有兩個(gè)開(kāi)放讀碼框serp1425與serp1424,其中SERP1424與vraS有4個(gè)堿基是重疊的,在其下游有一反向重復(fù)序列結(jié)構(gòu)。表皮葡萄球菌VraSR與其他細(xì)菌類(lèi)似物具有高度同源性,與金黃色葡萄球菌VraSR同源性高達(dá)90%,與變異鏈球菌和乳酸乳球菌類(lèi)似物同源性為50-70%,與枯草桿菌類(lèi)似物同源性為50%。表皮葡萄球菌SE1457中VraS蛋白為胞膜蛋白(1047bp,編碼348aa),有四個(gè)結(jié)構(gòu)域,跨膜區(qū)(TM)氨基酸的疏水值高達(dá)4.0;反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白VraR為胞漿蛋白(630bp,編碼209aa),有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,含有HTH結(jié)構(gòu)域(Helix-turn-Helix基序),能夠與下游的靶基因啟動(dòng)子區(qū)DNA結(jié)合。2.經(jīng)酶切、PCR及測(cè)序鑒定,成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-vraR。在22℃,0.5 mM IPTG過(guò)夜誘導(dǎo)下,重組蛋白6His-VraR的表達(dá)量較理想。3.紙片彌散法結(jié)果顯示,表皮葡萄球菌SE1457對(duì)上述7種藥物的敏感性(抑菌圈)分別為15±0.5 mm、40.2±2.1 mm、45.3±2.6 mm、32.4±0.82 mm、27.6±0.66mm、34±1.32 mm、34.5±1.0 mm;ΔvraSR突變株對(duì)上述7種藥物的敏感性(抑菌圈)分別為19±0.54 mm、43.5±1.8 mm、49.6±1.9 mm、33.5±0.79 mm、28.5±0.79 mm、34.9±2.18 mm、34.8±0.99 mm。試管稀釋法結(jié)果顯示,SE1457野生株對(duì)上述6種藥物的敏感性(MIC值)分別為4μg/mL、0.5μg/mL、0.5μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、0.5μg/mL;ΔvraSR突變株對(duì)上述藥物的敏感性(MIC值)分別為1.0μg/mL、0.25μg/mL、0.25μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、0.5μg/mL。4.微量平板法檢測(cè)表皮葡萄球菌生物膜形成情況,SE1457野生株在上述四個(gè)時(shí)間點(diǎn)生物膜形成量(OD_(570))分別為1.52±0.09、2.13±0.27、2.55±0.05和2.67±0.19;ΔvraSR突變株生物膜形成量分別為0.72±0.02、0.95±0.06、1.23±0.23和1.41±0.21;SE1457野生株和ΔvraSR突變株生長(zhǎng)無(wú)明顯差異。5.轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)有73個(gè)基因差異表達(dá),其中有58個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào),15個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào),差異表達(dá)的基因主要涉及于糖代謝,磷酸鹽代謝,細(xì)胞壁合成,全局調(diào)節(jié)子等,而與耐藥性直接相關(guān)的基因(pbp2,murZ,sgtB等)轉(zhuǎn)錄水平未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)論1.在表皮葡萄球菌SE1457雙組分系統(tǒng)中VraSR,VraS為感受器,VraR為反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白,其編碼的基因vraSR可能與上游2個(gè)基因serp1424和serp1425共同形成一個(gè)更大的操縱子。2.重組蛋白6His-VraR表達(dá)的最佳條件為:IPTG誘導(dǎo)劑濃度為0.5 mM,表達(dá)溫度為22℃,誘導(dǎo)過(guò)夜(約12 h)。3.表皮葡萄球菌ΔvraSR突變株對(duì)作用于細(xì)菌細(xì)胞壁的藥物(萬(wàn)古霉素、氨芐青霉素、青霉素G)敏感性較野生株SE1457增高,而對(duì)其它作用機(jī)制藥物的敏感性與SE1457野生株相比差異無(wú)顯著性。ΔvraSR突變株的生物膜形成能力較野生株SE1457顯著降低。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果提示,表皮葡萄球菌VraSR不直接參與藥物敏感性的調(diào)控,可能是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞壁的完整性,糖和蛋白的代謝來(lái)影響表皮葡萄球菌生物膜的形成和藥物敏感性。
【圖文】：

vraSR 基因座位，粗體字母為操縱子基因之間的間隔序列或重復(fù)序列，，下劃線(xiàn)為起始終止密碼子。圖 1.1 表皮葡萄球菌 SE1457 vraSR 基因序列特點(diǎn)分析 表皮葡萄球菌 SE1457 VraS/VraR 氨基酸序列特點(diǎn)

性為52%-70%，它們與表皮葡萄球菌VraSR核苷酸序列同源性為50%-60%，氨基酸序列同源性為30%-50%，聚為第三類(lèi)；枯草桿菌單獨(dú)為一類(lèi)，它與表皮葡萄球菌VraSR的同源性約50%（表1.1，圖1.2）。
【學(xué)位授予單位】：大理大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R378.11

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 葉聯(lián)華;黃云超;楊達(dá)寬;李莉;許賡;趙光強(qiáng);馬千里;陳安寧;;聚氯乙烯材料表面細(xì)菌生物膜結(jié)構(gòu)觀察[J];生物醫(yī)學(xué)工程與臨床;2007年04期

本文編號(hào)：2628886