【摘要】：表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)(Epitranscriptome)是生命科學(xué)領(lǐng)域新興的前沿研究熱點,主要關(guān)注各種RNA水平的修飾,及其在細胞轉(zhuǎn)錄組中的分布和表觀調(diào)控作用,如近年來被廣泛研究的6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)。5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5-mC)修飾在生理狀態(tài)下存在于包括mRNA的多種RNA中。然而作為一種可逆的化學(xué)修飾,其動態(tài)調(diào)控機制還不清楚,特別是還沒有發(fā)現(xiàn)其特異性的去甲基化酶。另外,作為一種在哺乳動物RNA中普遍存在的修飾方式,其生理和病理功能尚不清楚,特別是其在基因表達調(diào)控中的功能尚有待于深入研究。研究mRNA中5-mC的調(diào)控及其功能是表觀轉(zhuǎn)錄組的一個重要方向。Tet蛋白(Ten-eleven Translocation,Tet)作為DNA甲基化的氧化酶,也能夠在體外氧化RNA中5-mC。Tet蛋白是否在哺乳動物細胞中調(diào)控mRNA中的5-mC修飾,其在不同的生理過程中發(fā)揮著怎樣的調(diào)控作用?這些科學(xué)問題有待進一步研究。天然免疫是抵御病原體的第一道防線,如何快速高效的識別和清除病原體,并維持免疫穩(wěn)態(tài),是天然免疫的根本科學(xué)問題。病原體感染激活免疫系統(tǒng),誘導(dǎo)炎癥反應(yīng),產(chǎn)生各種細胞因子進一步動員造血干細胞向髓系細胞分化,放大天然免疫應(yīng)答效應(yīng)是機體快速清除病原體的重要手段。髓系發(fā)生(Myelopoiesis)是急性或慢性感染的關(guān)鍵應(yīng)答反應(yīng),其表觀遺傳學(xué)機制尚未見報道,值得探究。Tet2不僅在造血干細胞的自我更新和分化中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用,多項研究也發(fā)現(xiàn)Tet2在造血系統(tǒng)多種惡性腫瘤中存在多位點突變,且Tet2基因突變導(dǎo)致的催化功能缺失與造血系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),特別是在髓系惡性腫瘤中,表明Tet2可能是一種重要的抑癌基因。此外,Tet2在炎癥消退過程中也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。Tet2是否也參與病原體感染誘導(dǎo)的髓系免疫細胞分化還有待研究。本課題圍繞Tet2是否參與感染誘導(dǎo)的髓系發(fā)生及其表觀調(diào)控機制展開研究。我們發(fā)現(xiàn),Tet2能夠通過抑制Socs3的mRNA水平而促進膿毒癥感染和寄生蟲感染誘導(dǎo)的髓系免疫細胞的分化擴增。Tet2通過Adar1抑制Socs3的表達,Adar1通過結(jié)合雙鏈RNA并以RNA編輯非依賴的方式降低Socs3 mRNA的穩(wěn)定性。進一步機制研究發(fā)現(xiàn)Tet2抑制了mRNA上5-mC的水平,Tet2缺失導(dǎo)致Socs3 mRNA 3′-UTR區(qū)域5-mC水平上升,可能通過5-mC特異性的結(jié)合蛋白影響該區(qū)域RNA雙鏈的形成,從而減少Adar1的結(jié)合。本研究揭示了DNA甲基化氧化酶Tet2分子能夠促進感染誘導(dǎo)的髓系天然免疫細胞的發(fā)生,從而促進機體對病原體的抵抗能力,為機體抵抗病原體感染的效應(yīng)機制提出了新觀點,也為有效防治感染性疾病提供了新思路和潛在藥物研發(fā)靶標(biāo)。同時,Tet2一直被認為是通過調(diào)控染色質(zhì)狀態(tài)來介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控,而本研究首次提出了Tet2作為RNA結(jié)合蛋白能夠在mRNA修飾水平參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的全新功能,為進一步研究Tet2的生理病理功能開辟了新的研究方向。第一部分Tet2通過抑制Socs3的表達而促進感染誘導(dǎo)的髓系免疫細胞分化在病原體感染過程中,機體需要從骨髓大量動員免疫細胞到外周血,以快速高效地清除入侵的病原體。同時,刺激造血的細胞因子以及炎性細胞因子促進了更多髓系細胞的發(fā)生。為了觀察Tet2在此過程中的作用,我們首先構(gòu)建了盲腸結(jié)扎穿孔誘導(dǎo)膿毒癥的小鼠模型,發(fā)現(xiàn)Tet2缺失顯著降低小鼠膿毒癥CLP模型的死亡率和臨床評分,其原因主要是Tet2缺失使得髓系終末細胞的動員顯著降低而避免了炎癥因子風(fēng)暴導(dǎo)致的組織器官損傷;另外我們還構(gòu)建了血吸蟲感染(慢性感染模型)誘導(dǎo)肥大細胞分化擴增的模型,發(fā)現(xiàn)Tet2缺失也能夠抑制寄生蟲感染誘導(dǎo)的肥大細胞的分化。說明Tet2在病原體感染誘導(dǎo)的髓系細胞分化中起著關(guān)鍵作用。為了進一步探究Tet2促進髓系發(fā)生的分子機制,我們對野生型和Tet2敲除的骨髓來源的肥大細胞進行了表達譜分析,發(fā)現(xiàn)PI3K-AKT和JAK-STAT信號通路的多個基因在Tet2缺失細胞中表達有顯著變化,其中包括JAK-STAT信號通路的關(guān)鍵抑制分子Socs3。進一步檢測發(fā)現(xiàn)Tet2敲除的造血祖/干細胞和肥大細胞中IL-3誘導(dǎo)的Socs3 mRNA和蛋白水平顯著增高,并且Tet2敲除細胞中,IL-3信號通路活化障礙,STAT5和AKT的磷酸化水平降低。而在Tet2敲除的細胞中通過siRNA沉默Socs3的表達后,IL-3信號通路活化水平有所恢復(fù)。這些結(jié)果提示Tet2通過抑制Socs3的表達,從而促進IL-3等細胞因子信號通路的活化,這可能是Tet2促進病原體感染誘導(dǎo)髓系免疫細胞發(fā)生的關(guān)鍵機制。第二部分Tet2通過Adar1在轉(zhuǎn)錄后水平抑制Socs3的表達進一步研究Tet2抑制Socs3表達的分子機制,我們發(fā)現(xiàn)Tet2抑制Socs3的表達并不是通過調(diào)控Socs3基因區(qū)的DNA甲基化水平,而是在轉(zhuǎn)錄后水平。這一結(jié)果提示了Tet2作為一種RNA結(jié)合蛋白可能具有廣泛的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控功能。我們通過構(gòu)建紫外交聯(lián)免疫共沉淀結(jié)合高通量測序體系,在全基因組范圍內(nèi)尋找Tet2結(jié)合的靶RNA分子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tet2結(jié)合的RNA種類中,80%屬于已知基因轉(zhuǎn)錄的mRNA,其中包括Socs3的3′-UTR區(qū)域。同時在RNA-seq數(shù)據(jù)中,我們發(fā)現(xiàn)野生型對照組中A-to-G突變的數(shù)目顯著高于Tet2敲除組,且更多富集于mRNA的3′-UTR區(qū)。Socs3 mRNA的3′-UTR區(qū)域也包含A-to-G突變位點。Adar1結(jié)合雙鏈RNA并介導(dǎo)A-to-I編輯,提示Adar1可能參與這些位點的編輯。在野生型細胞中干擾Adar1后Socs3表達上升,但報告基因結(jié)果顯示Adar1對Socs3的調(diào)控不依賴其酶催化活性。有文獻報道Adar1能夠其他RNA結(jié)合蛋白在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達,而不依賴其RNA編輯功能。我們通過免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜檢測發(fā)現(xiàn),Adar1能夠與調(diào)控mRNA穩(wěn)定性的RNA結(jié)合蛋白結(jié)合,可能通過這些蛋白發(fā)揮抑制Socs3的功能。通過進一步探究Tet2在Adar1介導(dǎo)的Socs3抑制功能中的作用,我們發(fā)現(xiàn)在Tet2敲除細胞中干擾Adar1不能升高Socs3的表達,結(jié)合過表達實驗發(fā)現(xiàn),Tet2以酶活性依賴的方式促進Adar1對Socs3表達的抑制作用,而同時又不依賴于其DNA結(jié)合功能。第三部分Tet2通過抑制mRNA中5-mC的水平而參與Socs3的轉(zhuǎn)錄后抑制Tet2能將DNA上的5-mC催化氧化成為5-hmC,同時,RNA上的5-mC修飾也被發(fā)現(xiàn)存在果蠅和人類細胞系中。為了研究Tet2能否通過氧化的方式降低mRNA中5-mC,我們構(gòu)建了Tet2體外催化體系,通過質(zhì)譜和點雜交檢測發(fā)現(xiàn)Tet2能夠在體外和體內(nèi)以底物依賴的方式降低mRNA上的甲基化修飾水平,并且在Tet2敲除細胞中,我們發(fā)現(xiàn)mRNA上的5-mC修飾水平升高。而野生型細胞中胞嘧啶上的其他甲基化氧化修飾5-hmC、5-fC和5-caC的含量則很低。通過建立RNA甲基化組分析,發(fā)現(xiàn)在mRNA上存在5-mC修飾,且在Tet2敲除細胞中5-mC水平顯著升高。以上結(jié)果說明Tet2能夠以氧化依賴的方式抑制mRNA上5-mC的水平。進一步實驗發(fā)現(xiàn)5-mC的存在能夠抑制Adar1與其靶RNA的結(jié)合。DNA或者RNA的修飾能夠招募特異性蛋白發(fā)揮表觀調(diào)控功能,通過RNA 5-mC結(jié)合蛋白實驗分析,發(fā)現(xiàn)5-mC能夠結(jié)合一些ATP依賴的RNA解旋酶,這些蛋白跟RNA二級結(jié)構(gòu)的改變和雙鏈解旋有關(guān),而Adar1結(jié)合雙鏈RNA。以上結(jié)果說明mRNA上的5-mC修飾能夠抑制Adar1功能,可能是通過抑制雙鏈RNA的形成使Adar1結(jié)合減少的原因。綜上所述,Tet2能夠通過氧化依賴的方式降低mRNA上5-mC修飾的水平,Tet2的缺失使mRNA上5-mC修飾的水平升高,從而抑制Adar1的功能。我們發(fā)現(xiàn)Tet2可能通過抑制5-mC水平促進雙鏈RNA的形成,而雙鏈RNA是Adar1結(jié)合所必需的。結(jié)合野生型和Tet2敲除細胞中轉(zhuǎn)錄組突變位點的對比分析,我們也揭示了Tet2和Adar1功能上的廣泛聯(lián)系。此外,我們還發(fā)現(xiàn),內(nèi)源性mRNA上5-hmC的數(shù)量遠遠少于5-mC,說明從5-hmC如何轉(zhuǎn)換為未甲基化的胞嘧啶需要其他的酶或者更多催化步驟。Tet2在轉(zhuǎn)錄后水平降低JAK-STAT信號通路的關(guān)鍵負調(diào)控分子Socs3的mRNA的穩(wěn)定性,維持了細胞因子如IL-3信號通路的持續(xù)活化,促進了病原體感染誘導(dǎo)的髓系天然免疫細胞的分化,為抗感染免疫的表觀調(diào)控提供了新的機制。
【圖文】：

三、結(jié)果（一）Tet2 缺失降低膿毒癥引起的髓系天然免疫細胞發(fā)生我們首先構(gòu)建了小鼠盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）模型。當(dāng)小鼠發(fā)生盲腸穿孔菌的腸內(nèi)容物持續(xù)漏入腹腔引起感染，首先誘發(fā)腹膜炎，導(dǎo)致腸道細菌循環(huán)，激活免疫系統(tǒng)誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)，這一過程中也觸發(fā)骨髓內(nèi)髓系細胞的動員，如中性粒細胞和單核細胞分化以有效清除病原體。同時，免疫細胞的模式識別受體（PRRs）會識別細菌的病原體相關(guān)分子模式（動炎癥反應(yīng)，分泌大量炎性細胞因子和趨化因子，進一步激活和招募各胞，放大炎癥反應(yīng)。而炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致組織和器官損傷，而釋放胞內(nèi)的損傷相關(guān)分子模式進一步活化免疫細胞，再次放大炎癥反應(yīng)。過度的炎炎性細胞因子風(fēng)暴，導(dǎo)致內(nèi)毒素休克，甚至機體死亡。我們發(fā)現(xiàn)，與對照組小鼠相比，，Tet2 敲除小鼠在該模型中死亡率和臨床低（圖 1-1A，B），表明 Tet2 敲除小鼠膿毒癥的嚴重程度與對照小鼠比更造模 24 小時內(nèi)，腹腔和外周血中早期的細菌數(shù)量在 Tet2 敲除小鼠和野生間沒有顯著差異（圖 1-1C）。

缺失減弱敗血癥引起的髓系發(fā)生動員educed emergency myelopoiesis in Tet2-deficient mice in abd of Tet2-deficient (KO) and the littermate control (WT) micB) Cell enumeration (n = 6). (C) Levels of cytokines in serubiologically independent mice).**P < 0.01, Unpaired two-sided Student’s t-test, mean and siologically independent animals.et2 促進寄生蟲感染誘導(dǎo)的肥大細胞分化擴失是否影響病原體慢性感染誘導(dǎo)的髓系免疫細胞擴增？帶小鼠寄生蟲感染模型，檢測 Tet2 是否影響寄生蟲感染誘發(fā)骨髓造血干細胞來源的肥大細胞廣泛分布于粘膜組織中，現(xiàn)肥大細胞不僅是 IgE 介導(dǎo)的速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的效應(yīng)細胞和招募炎性細胞，近年來的研究對其在感染性疾病中的作關(guān)注。我們利用缺失肥大細胞的 kitw-sh/w-sh小鼠構(gòu)建腸道寄
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R392

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本文編號：2629216