【摘要】：結(jié)核病(Tuberculosis)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tubercuulosiis)感染引起的傳染性疾病,對人類的危害十分嚴重,已成為第二大致死性傳染病,每年造成約200萬人死亡。已發(fā)現(xiàn)的結(jié)核分枝桿菌分泌系統(tǒng)有SecAl、SecA2、Tat、ESX共四種,其中ESX分泌系統(tǒng)最初是在分泌蛋白ESAT-6和CFP-10的分泌過程中發(fā)現(xiàn)的,它一般轉(zhuǎn)運缺少傳統(tǒng)信號肽序列的蛋白質(zhì),與毒力和致病性密切相關(guān)。ESX分泌系統(tǒng)共包含5個相互獨立的分系統(tǒng),分別為ESX-1、ESX-2、ESX-3、ESX-4及ESX-5。ESX-1分系統(tǒng)參與細菌入侵宿主細胞和機體調(diào)控的防御過程,是目前研究最多的分系統(tǒng)。在此分泌系統(tǒng)的組成蛋白中,由rv3882c基因編碼的MtRv3882c蛋白(EccE蛋白),是ESX-1分泌系統(tǒng)中一個保守的組分。但目前為止,仍沒有結(jié)構(gòu)與功能明確的同源蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu),因此無法了解Rv3882c蛋白的三級結(jié)構(gòu),也就無法了解其在機體中扮演的角色與功能。目前酵母雙雜交實驗證實MtRv3882c會與胞質(zhì)蛋白MtRv3614c相互作用形成異源復(fù)合物促進相關(guān)分泌蛋白的分泌,同時也有研究稱MtRv3882c蛋白是與其他幾種ESX系統(tǒng)保守蛋白(EccB、EccC、EccD)結(jié)合在一起構(gòu)成大的膜蛋白復(fù)合物(約1.5 MDa),形成底物遷移通道(transloaction channel)促進物質(zhì)分泌。本課題中我們采用大腸桿菌表達系統(tǒng),表達純化MtRv3882c-TM(跨膜區(qū))的單突變體及雙突變體蛋白,獲取狀態(tài)均一、純度較高的目的蛋白。然后結(jié)合位點特異性自旋標(biāo)記與電子順磁共振技術(shù),探究MtRv3882c蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)特征。在去污劑膠束載體環(huán)境下,通過電子順磁共振技術(shù)獲取標(biāo)記后的跨膜結(jié)構(gòu)域的運動性、易趨性及距離測量等信息,判斷起止位點、二級結(jié)構(gòu)特征以及跨膜螺旋的取向信息,綜合得出MtRv3882c-TM的結(jié)構(gòu)模型。通過CW-EPR實驗我們獲取了跨膜區(qū)位點側(cè)鏈的AH-1和H2-1以及譜寬Azz值等動力學(xué)參數(shù),去污劑膠束中跨膜區(qū)位點側(cè)鏈的動力學(xué)參數(shù)均高于無規(guī)卷曲的值,這表明跨膜螺旋區(qū)位點的運動性更低,無規(guī)卷曲處位點的運動性更高。同時通過功率飽和實驗測量Mt0082蛋白在去污劑膠束中的易趨性信息,分析出位點35到54的ΠNiEDDA值保持在一個較低的水平,即這些位點所在的區(qū)域疏水性較強;ΠIo2值的結(jié)果表明位點35到54的值保持在一個很高的范圍,然后結(jié)合Φ值的變化情況來看,跨膜區(qū)及其兩側(cè)序列總體呈現(xiàn)出一種“親水-疏水-親水-疏水-親水”的交替變化模型。通過我們的研究,將為MtRv3882c蛋白結(jié)構(gòu)與功能提供依據(jù)。同時,本課題也為拓展SDSL-EPR技術(shù)在膜蛋白研究中的應(yīng)用提供思路與方法。
【圖文】：

于外磁場Ｂ0時，會產(chǎn)生兩種取向的自旋磁矩：自旋磁矩方向與外磁場反向平行逡逑（Ｍｓ邋＝邋＋ｌ／２），此時電子處于較高能級；另一種與外磁場正向平行（Ｍｓ＝－ｌ／２），這逡逑時電子會處于較低能級。圖１．１所示的為電子在外磁場中存在兩種不同能級的逡逑不意圖：逡逑１逡逑

Ｆｉｇｕｒｅ邋１．２邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆＸ－ｂａｎｄ邋ＥＰＲ邋ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ逡逑一套完整的電子順磁共振譜儀是由磁場系統(tǒng)、微波系統(tǒng)、諧振腔、調(diào)制系統(tǒng)、逡逑檢測系統(tǒng)及計算機系統(tǒng)等部分組成的。圖１．２所示的是標(biāo)準Ｘ波段ＥＰＲ光譜逡逑儀示意圖。圖中左測為一種速調(diào)管或者耿氏二極管的微波源，用于輸出２００邋ｍＷ逡逑恒定或１０％的可調(diào)諧頻率。其產(chǎn)生的輻射通過矩形空心波導(dǎo)管傳輸?shù)剿p器中，逡逑通常在衰減器中２００邋ｍＷ的功率可以降低丨到１０６倍。衰減器的輸出輻射通逡逑過波導(dǎo)管繼續(xù)傳輸?shù)窖h(huán)器，循環(huán)器使微波進入下行傳導(dǎo)到達包含樣本的諧振器。逡逑在微波進入諧振器之前，遇到了虹膜，這是一種調(diào)節(jié)從諧振器反射回來的輻射量逡逑的裝置。反射的輻射返回到循環(huán)器，然后被強迫進入右邊的波導(dǎo)進入一個二極管逡逑來檢測微波強度。而從探測器反射回來的剩余輻射都被循環(huán)器強迫進入向上波導(dǎo)，逡逑該向上波導(dǎo)以楔形、錐形或“扼流圈”的形式結(jié)束并轉(zhuǎn)化成熱量，，這樣就不會有逡逑輻射返回到微波源。在衰減器進入包含可關(guān)閉端口的參考臂波導(dǎo)之前
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R378.911

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1 蔡文廣;結(jié)核分枝桿菌內(nèi)膜蛋白Rv3882c跨膜結(jié)構(gòu)域的動力學(xué)與結(jié)構(gòu)研究[D];安徽大學(xué);2019年

本文編號：2628708