【摘要】：人巨細(xì)胞病毒(HCMV)是一種典型的β皰疹病毒,因其在人體內(nèi)可長(zhǎng)期潛伏感染而成為最危害人類(lèi)健康的病毒之一。HCMV具有多種免疫逃避機(jī)制逃避宿主的免疫應(yīng)答從而在體內(nèi)傳播和擴(kuò)散。HCMV的UL146基因是HCMV的UL/b’區(qū)的一個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF),編碼一種有助于病毒潛伏和擴(kuò)散的α趨化因子vCXCL-1。然而由于缺少一些研究工具如vCXCL-1蛋白的抗體,這些分子機(jī)制并沒(méi)有很詳細(xì)的研究。為了進(jìn)一步研究vCXCL-1進(jìn)行免疫逃避的機(jī)制,本研究制備了針對(duì)vCXCL-1的多克隆抗體,為UL146在HCMV潛伏中所扮演的角色研究提供了有效的工具。本文主要通過(guò)原核表達(dá)人巨細(xì)胞病毒UL146基因編碼蛋白vCXCL-1免疫新西蘭大白兔的方法來(lái)制備多克隆抗體,方法如下:(1)HCMV Towne UL146基因全長(zhǎng)的克隆構(gòu)建:首先以HCMV BAC Towne文庫(kù)為模板擴(kuò)增出HCMV Towne UL146基因全長(zhǎng),將UL146全長(zhǎng)基因經(jīng)雙酶切插入到原核表達(dá)載體pET32a(+)中,將載體與目的片段經(jīng)T4連接酶連接后導(dǎo)入大腸桿菌DH5α中進(jìn)行克隆,對(duì)構(gòu)建好的克隆菌提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和測(cè)序鑒定。(2)重組質(zhì)粒的原核誘導(dǎo)表達(dá):將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pET32a(+)-UL146導(dǎo)入到大腸桿菌BL21(DE3)宿主表達(dá)菌中加入誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),優(yōu)化出重組蛋白在原核細(xì)胞中表達(dá)的最佳溫度、誘導(dǎo)劑濃度和時(shí)間,并用Western blot方法分析重組蛋白在原核中的表達(dá)形式。(3)重組蛋白的純化:在優(yōu)化好的條件下將重組蛋白進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá),分離出菌體經(jīng)超聲破碎后用8 M尿素溶解,將溶解后的蛋白經(jīng)鎳柱分離純化,并將純化后的蛋白進(jìn)行透析除鹽,用SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)合灰度掃描分析純化后的蛋白的純度。(4)多克隆抗體的制備及鑒定:以純化后的蛋白作為免疫抗原,經(jīng)超濾濃縮和蛋白定量后采用皮下多點(diǎn)注射法免疫新西蘭大白兔,獲得抗血清,將符合效價(jià)的抗血清進(jìn)行純化得到純度較高的多克隆抗體,并用Western blot定性檢測(cè)多克隆抗體。(5)多克隆抗體的應(yīng)用:用anti-vCXCL-1兔多克隆抗體作為一抗,用Western blot法檢測(cè)病毒天然蛋白vCXCL-1在細(xì)胞中的表達(dá)情況,用間接免疫熒光法檢測(cè)病毒天然蛋白vCXCL-1在細(xì)胞中的定位情況。通過(guò)以上方法獲得的結(jié)果如下:(1)HCMV Towne UL146基因全長(zhǎng)的克隆構(gòu)建:成功從HCMV BAC Towne文庫(kù)中擴(kuò)增出HCMV Towne UL146基因全長(zhǎng),將UL146全長(zhǎng)基因插入到原核表達(dá)載體pET32a(+)的兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)Sal I和BamH I之間構(gòu)建克隆,陽(yáng)性克隆經(jīng)雙酶切鑒定和測(cè)序鑒定正確。(2)重組質(zhì)粒的原核誘導(dǎo)表達(dá):將測(cè)序正確的pET32a(+)-UL146重組質(zhì)粒成功導(dǎo)入至大腸桿菌BL21(DE3)宿主表達(dá)菌后,經(jīng)誘導(dǎo)條件優(yōu)化,確定重組蛋白在原核細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)的最佳溫度為20℃,最佳誘導(dǎo)劑濃度為0.5 mM,最佳誘導(dǎo)時(shí)間為10 h,并確定重組蛋白在原核細(xì)胞中以包涵體的形式表達(dá)。(3)重組蛋白的純化:重組蛋白經(jīng)鎳柱純化后經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳并結(jié)合灰度掃描分析出蛋白純度較高,達(dá)80%以上,可用于動(dòng)物免疫。(4)多克隆抗體的制備及鑒定:免疫后獲得的抗血清經(jīng)ELISA測(cè)定,效價(jià)達(dá)100,000,經(jīng)Western blot分析,anti-vCXCL-1多克隆抗體可定性檢測(cè)vCXCL-1重組蛋白。(5)多克隆抗體的應(yīng)用:經(jīng)Western blot分析,anti-vCXCL-1多克隆抗體可檢測(cè)病毒天然蛋白vCXCL-1在細(xì)胞中的表達(dá);經(jīng)間接免疫熒光分析,anti-vCXCL-1多克隆抗體可檢測(cè)病毒天然蛋白vCXCL-1在細(xì)胞中的定位。綜上,本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建pET32a(+)-UL146重組質(zhì)粒,將其導(dǎo)入BL21(DE3)宿主菌誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)條件優(yōu)化,成功獲得以包涵體形式存在的高表達(dá)量的重組蛋白,重組蛋白經(jīng)鎳柱純化后獲得高純度的重組蛋白并將其作為免疫兔子的抗原,經(jīng)數(shù)次免疫后獲得高效價(jià)的抗血清,將抗血清進(jìn)行純化獲得高質(zhì)量的多克隆抗體,對(duì)獲得的多克隆抗體進(jìn)行定性分析表明成功獲得anti-vCXCL-1多克隆抗體,并且該抗體可用于檢測(cè)病毒天然蛋白vCXCL-1在細(xì)胞中的表達(dá)和定位。
【圖文】：

暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文第一章 緒論細(xì)胞病毒概述細(xì)胞病毒（HCMV）是一種廣泛存在于人體內(nèi)的雙鏈 DNA 病毒毒家族，具有種屬特異性。HCMV 于 1956 年首次從唾液腺中分粒子結(jié)構(gòu)如圖 1 所示，該病毒顆粒直徑約 230 nm，衣殼成二十面約 100 nm，由含 150 個(gè)六鄰體及 12 個(gè)五鄰體的殼粒構(gòu)成，包膜（1一層皮層（厚約 50 nm）隔開(kāi)。HCMV 的浮力密度（1.716 g/cm3細(xì)胞 DNA 浮力密度。

株是低傳代臨床株，在 HFF 細(xì)胞中可傳代次數(shù)較少。Dolan 等人對(duì)其基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，Merlin 株基因組大小為 235645 bp，其中 UL 大小為 193019 bp, US 大小為35481 bp，RL 大小為 1324 bp，RS 為 2537 bp[4]。與 Merlin 株相比，AD169 株在基因組結(jié)構(gòu)上有突變。AD169 株與 Toledo 株相比缺失了一段 15 kbp 的片段[3]。Towne 株屬于高傳代株，野生型的 Towne 株與 Toledo 株相比缺失了約 13 kbp 的片段[3]。Andrew Marchini 等人將 HCMV Towne 株進(jìn)行了細(xì)菌人工染色體（BAC）克隆，并將其分別轉(zhuǎn)化于大腸桿菌及轉(zhuǎn)染于 HFF 細(xì)胞中并測(cè)定其產(chǎn)生噬菌斑的能力，結(jié)果表明他們成功構(gòu)建了帶有 GFP 標(biāo)簽的 HCMV Towne 的 BAC（T-BACwt DNA），且與野生型的 Towne 株相比它們之間的感染能力沒(méi)有明顯差別[6]。隨即，Walter Dunn 等人對(duì) T-BACwt DNA 采用鳥(niǎo)槍法進(jìn)行測(cè)序分析（如圖 2）發(fā)現(xiàn)，該 TowneBAC最少編碼 162 個(gè) ORFs，同樣，Towne 株由 UL 和 US構(gòu)成，，兩側(cè)存在反向重復(fù)序列 RL 和 RS。他們的研究還發(fā)現(xiàn)有 45 個(gè) ORFs 對(duì)于HCMV 在 HFF 中的復(fù)制是必須的而另外 117 個(gè) ORFs 是非必需的[7]。
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R373

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本文編號(hào)：2628680