【摘要】：人巨細胞病毒(HCMV)是一種典型的β皰疹病毒,因其在人體內(nèi)可長期潛伏感染而成為最危害人類健康的病毒之一。HCMV具有多種免疫逃避機制逃避宿主的免疫應(yīng)答從而在體內(nèi)傳播和擴散。HCMV的UL146基因是HCMV的UL/b’區(qū)的一個開放閱讀框(ORF),編碼一種有助于病毒潛伏和擴散的α趨化因子vCXCL-1。然而由于缺少一些研究工具如vCXCL-1蛋白的抗體,這些分子機制并沒有很詳細的研究。為了進一步研究vCXCL-1進行免疫逃避的機制,本研究制備了針對vCXCL-1的多克隆抗體,為UL146在HCMV潛伏中所扮演的角色研究提供了有效的工具。本文主要通過原核表達人巨細胞病毒UL146基因編碼蛋白vCXCL-1免疫新西蘭大白兔的方法來制備多克隆抗體,方法如下:(1)HCMV Towne UL146基因全長的克隆構(gòu)建:首先以HCMV BAC Towne文庫為模板擴增出HCMV Towne UL146基因全長,將UL146全長基因經(jīng)雙酶切插入到原核表達載體pET32a(+)中,將載體與目的片段經(jīng)T4連接酶連接后導(dǎo)入大腸桿菌DH5α中進行克隆,對構(gòu)建好的克隆菌提取質(zhì)粒進行雙酶切和測序鑒定。(2)重組質(zhì)粒的原核誘導(dǎo)表達:將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pET32a(+)-UL146導(dǎo)入到大腸桿菌BL21(DE3)宿主表達菌中加入誘導(dǎo)劑進行誘導(dǎo)表達,優(yōu)化出重組蛋白在原核細胞中表達的最佳溫度、誘導(dǎo)劑濃度和時間,并用Western blot方法分析重組蛋白在原核中的表達形式。(3)重組蛋白的純化:在優(yōu)化好的條件下將重組蛋白進行大量誘導(dǎo)表達,分離出菌體經(jīng)超聲破碎后用8 M尿素溶解,將溶解后的蛋白經(jīng)鎳柱分離純化,并將純化后的蛋白進行透析除鹽,用SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)合灰度掃描分析純化后的蛋白的純度。(4)多克隆抗體的制備及鑒定:以純化后的蛋白作為免疫抗原,經(jīng)超濾濃縮和蛋白定量后采用皮下多點注射法免疫新西蘭大白兔,獲得抗血清,將符合效價的抗血清進行純化得到純度較高的多克隆抗體,并用Western blot定性檢測多克隆抗體。(5)多克隆抗體的應(yīng)用:用anti-vCXCL-1兔多克隆抗體作為一抗,用Western blot法檢測病毒天然蛋白vCXCL-1在細胞中的表達情況,用間接免疫熒光法檢測病毒天然蛋白vCXCL-1在細胞中的定位情況。通過以上方法獲得的結(jié)果如下:(1)HCMV Towne UL146基因全長的克隆構(gòu)建:成功從HCMV BAC Towne文庫中擴增出HCMV Towne UL146基因全長,將UL146全長基因插入到原核表達載體pET32a(+)的兩個限制性酶切位點Sal I和BamH I之間構(gòu)建克隆,陽性克隆經(jīng)雙酶切鑒定和測序鑒定正確。(2)重組質(zhì)粒的原核誘導(dǎo)表達:將測序正確的pET32a(+)-UL146重組質(zhì)粒成功導(dǎo)入至大腸桿菌BL21(DE3)宿主表達菌后,經(jīng)誘導(dǎo)條件優(yōu)化,確定重組蛋白在原核細胞中誘導(dǎo)表達的最佳溫度為20℃,最佳誘導(dǎo)劑濃度為0.5 mM,最佳誘導(dǎo)時間為10 h,并確定重組蛋白在原核細胞中以包涵體的形式表達。(3)重組蛋白的純化:重組蛋白經(jīng)鎳柱純化后經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳并結(jié)合灰度掃描分析出蛋白純度較高,達80%以上,可用于動物免疫。(4)多克隆抗體的制備及鑒定:免疫后獲得的抗血清經(jīng)ELISA測定,效價達100,000,經(jīng)Western blot分析,anti-vCXCL-1多克隆抗體可定性檢測vCXCL-1重組蛋白。(5)多克隆抗體的應(yīng)用:經(jīng)Western blot分析,anti-vCXCL-1多克隆抗體可檢測病毒天然蛋白vCXCL-1在細胞中的表達;經(jīng)間接免疫熒光分析,anti-vCXCL-1多克隆抗體可檢測病毒天然蛋白vCXCL-1在細胞中的定位。綜上,本實驗成功構(gòu)建pET32a(+)-UL146重組質(zhì)粒,將其導(dǎo)入BL21(DE3)宿主菌誘導(dǎo)表達,經(jīng)條件優(yōu)化,成功獲得以包涵體形式存在的高表達量的重組蛋白,重組蛋白經(jīng)鎳柱純化后獲得高純度的重組蛋白并將其作為免疫兔子的抗原,經(jīng)數(shù)次免疫后獲得高效價的抗血清,將抗血清進行純化獲得高質(zhì)量的多克隆抗體,對獲得的多克隆抗體進行定性分析表明成功獲得anti-vCXCL-1多克隆抗體,并且該抗體可用于檢測病毒天然蛋白vCXCL-1在細胞中的表達和定位。
【圖文】：

暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文第一章 緒論細胞病毒概述細胞病毒（HCMV）是一種廣泛存在于人體內(nèi)的雙鏈 DNA 病毒毒家族，具有種屬特異性。HCMV 于 1956 年首次從唾液腺中分粒子結(jié)構(gòu)如圖 1 所示，該病毒顆粒直徑約 230 nm，衣殼成二十面約 100 nm，由含 150 個六鄰體及 12 個五鄰體的殼粒構(gòu)成，包膜（1一層皮層（厚約 50 nm）隔開。HCMV 的浮力密度（1.716 g/cm3細胞 DNA 浮力密度。

株是低傳代臨床株，在 HFF 細胞中可傳代次數(shù)較少。Dolan 等人對其基因組測序發(fā)現(xiàn)，Merlin 株基因組大小為 235645 bp，其中 UL 大小為 193019 bp, US 大小為35481 bp，RL 大小為 1324 bp，RS 為 2537 bp[4]。與 Merlin 株相比，AD169 株在基因組結(jié)構(gòu)上有突變。AD169 株與 Toledo 株相比缺失了一段 15 kbp 的片段[3]。Towne 株屬于高傳代株，野生型的 Towne 株與 Toledo 株相比缺失了約 13 kbp 的片段[3]。Andrew Marchini 等人將 HCMV Towne 株進行了細菌人工染色體（BAC）克隆，并將其分別轉(zhuǎn)化于大腸桿菌及轉(zhuǎn)染于 HFF 細胞中并測定其產(chǎn)生噬菌斑的能力，結(jié)果表明他們成功構(gòu)建了帶有 GFP 標簽的 HCMV Towne 的 BAC（T-BACwt DNA），且與野生型的 Towne 株相比它們之間的感染能力沒有明顯差別[6]。隨即，Walter Dunn 等人對 T-BACwt DNA 采用鳥槍法進行測序分析（如圖 2）發(fā)現(xiàn)，該 TowneBAC最少編碼 162 個 ORFs，同樣，Towne 株由 UL 和 US構(gòu)成，，兩側(cè)存在反向重復(fù)序列 RL 和 RS。他們的研究還發(fā)現(xiàn)有 45 個 ORFs 對于HCMV 在 HFF 中的復(fù)制是必須的而另外 117 個 ORFs 是非必需的[7]。
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R373

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本文編號：2628680