【摘要】：背景和目的:干細(xì)胞是體內(nèi)一種可以自我增殖、多向分化以及具有強(qiáng)大的旁分泌功能的細(xì)胞。而脂肪干細(xì)胞因其大量體內(nèi)脂肪組織來源,其強(qiáng)大的自我增殖及旁分泌能力可應(yīng)用于臨床,治療多種疾病,例如糖尿病足的難愈性創(chuàng)面[1]。但干細(xì)胞經(jīng)過體外的培養(yǎng)擴(kuò)增過程中,細(xì)胞會出現(xiàn)衰老,形態(tài)會發(fā)生改變,其增殖分化潛能會明顯的降低,并且細(xì)胞更容受到外界的環(huán)境影響而死亡[2]。這無疑大大影響了細(xì)胞的治療效果。對于提升干細(xì)胞治療潛能的方法有很多,例如人工支架材料[3]、異種生物材料[4]等。這些方法都不可避免的引入了外來材料,或者加入可能對機(jī)體有害的化學(xué)試劑[5]。本身存在相對更高的治療成本,更是引入了相對潛在的危險因素,可能對機(jī)體造成損害。根據(jù)研究團(tuán)隊(duì)成員之前的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)可以知道,本身存在于細(xì)胞外基質(zhì)中的成分透明質(zhì)酸可以用于三維的細(xì)胞培養(yǎng)[6]。其具有非常安全的生物性能。通過三維培養(yǎng)微球的方式可以增加干細(xì)胞的干細(xì)胞潛能,細(xì)胞的干細(xì)胞標(biāo)志物明顯發(fā)生上調(diào),細(xì)胞存活率大大增加[7],其增殖分化旁分泌功能得到明顯提升。同時來自于外周血中的內(nèi)皮細(xì)胞集落形成細(xì)胞,其具有非常強(qiáng)的自我增殖潛能。其中高增值潛能的內(nèi)皮細(xì)胞集落形成細(xì)胞單個細(xì)胞具有集落形成能力。其與脂肪干細(xì)胞存在相互作用。一方面可以增加其干細(xì)胞潛能。另一方面可以增加脂肪干細(xì)胞的存活[8]。本實(shí)驗(yàn)的目的在于通過利用透明質(zhì)酸三維培養(yǎng)經(jīng)過反復(fù)傳代后的衰老脂肪干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞集落形成細(xì)胞構(gòu)建三維空間結(jié)構(gòu),從而增加脂肪干細(xì)胞的干細(xì)胞潛能,減少其在體內(nèi)過快死亡,增加對疾病的治療效果。實(shí)驗(yàn)方法:1、獲取經(jīng)過反復(fù)傳代的衰老脂肪干細(xì)胞常規(guī)用直徑3.5mm多側(cè)孔吸脂針對健康女性病人腹部脂肪進(jìn)行抽脂。將獲取的脂肪注入血袋中,在冰水混合物中靜置直至血水與上層脂肪明顯分層。放出下層血水,留置上層脂肪分裝于50ml離心管至一半。加入25ml磷酸緩沖鹽溶液到離心管中,充分搖勻后離心機(jī)1200g離心3分鐘。棄去下層液體,保留中層的脂肪,倒除上層過多的油滴。配置0.075%膠原酶I溶液消化脂肪組織,放置在37度水浴搖床30分鐘。用全培中和膠原酶I,離心后去上層油滴和未消化完的脂肪組織,取下層細(xì)胞團(tuán)接種于培養(yǎng)皿上。反復(fù)培養(yǎng)至第八代(即為是衰老脂肪干細(xì)胞)。2、獲取內(nèi)皮細(xì)胞集落形成細(xì)胞抽取健康女性外周血20毫升,1:1混合磷酸鹽溶液后加入淋巴細(xì)胞分離液。低速離心30分鐘。取中間白色云霧狀細(xì)胞層,即血液中的單個核細(xì)胞。接種于膠原I鋪板的培養(yǎng)皿中直至細(xì)胞集落出現(xiàn)。細(xì)胞個數(shù)約為2000個時傳代。3、本課題實(shí)驗(yàn)選取的實(shí)驗(yàn)動物為裸鼠,自制小型圓柱形鉛柱,中間留一縫隙揪出裸鼠皮膚,透明膠帶固定。麻醉裸鼠后固定在放射源下,輻照15格雷。靜待一個月使裸鼠皮膚發(fā)生慢性纖維化,此時用剪出剪出一個7mm的全層皮膚創(chuàng)面。用三維培養(yǎng)后的細(xì)胞與對照組治療創(chuàng)面。對照組劃分為:第八代脂肪干細(xì)胞、三維培養(yǎng)第八代脂肪干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞集落形成細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞集落形成細(xì)胞。4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果三維培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞集落形成細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞的組出現(xiàn)類似于血管結(jié)構(gòu)的空間結(jié)構(gòu),嘗試單純用第八代的脂肪干細(xì)胞三維培養(yǎng)存在大量無法形成空間結(jié)構(gòu)的單個細(xì)胞,其漂浮于透明質(zhì)酸中發(fā)生死亡。隨著創(chuàng)面治療時間的推移,所有的實(shí)驗(yàn)組和對照組創(chuàng)面都趨于愈合。然而,三維培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞集落形成細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞的組治療效果最佳,其余三組之間無明顯差異。三維培養(yǎng)組能更好的組織中存活下來,并且參與組成血管結(jié)構(gòu),而單純脂肪干細(xì)胞組在宿主體內(nèi)大量被代謝掉僅少量殘存在間質(zhì)中,也未能參與機(jī)體組織結(jié)構(gòu)組成。組織的再生情況也明顯不如三維培養(yǎng)組。
【圖文】：

邐第一章脂肪干細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞集落形成細(xì)胞的提�。保硨�(shí)驗(yàn)結(jié)果：逡逑Ｋｊｆ：r2邋｜邋ｆ４邋丨邐＜邐，聲，，，逡逑＞／－邐．．／Ｖ．邐．？一逡逑＾邋■邋＊．．逡逑－‘邋？．逡逑，ｖ；邋＼ｖ＾ｖｖ＾＾－邋．ｒ邋ｖ，邋，；邐＾逡逑（第三代脂肪干細(xì)胞，Ｐ３－ＡＳＣ）邐（第八代脂肪干細(xì)胞，Ｐ８－ＡＳＣ）逡逑

２．２材料與方法逡逑１、我們將根據(jù)團(tuán)隊(duì)成員以往的透明質(zhì)酸三維培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)，準(zhǔn)備采�。常サ牡耐稿义厦髻|(zhì)酸鈉。首先把天平放入超凈臺中，用酒精擦拭后敞開天平的玻璃門待其自然逡逑風(fēng)干。用紫外線輻照一小時消毒。先將培養(yǎng)皿放入天平上調(diào)零，逐步加入透明質(zhì)逡逑酸鈉粉末，再加入混有１％雙抗的培養(yǎng)基。配置濃度稍大于３％邋（算入后續(xù)細(xì)胞混逡逑懸液體積）。培養(yǎng)箱中靜置過夜待透明質(zhì)酸鈉與水充分混勻。逡逑２、將培養(yǎng)的細(xì)胞分別加入到培養(yǎng)皿中，３７度培養(yǎng)箱靜置過夜。次日收集細(xì)逡逑胞用于動物實(shí)驗(yàn)、檢測。逡逑實(shí)驗(yàn)過程中所用到的不同細(xì)胞：脂肪干細(xì)胞三維培養(yǎng)組、內(nèi)皮細(xì)胞集落形成逡逑細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞混合培養(yǎng)組、脂肪干細(xì)胞混懸液、內(nèi)皮細(xì)胞集落形成細(xì)胞混懸逡逑液。逡逑２．３結(jié)果逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R329.2;R574.62

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本文編號：2625304