【摘要】：目的:研究登革Ⅱ型病毒(Dengue virus type 2,DENV-2)感染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)和人巨噬細(xì)胞,且感染后共培養(yǎng)對(duì)主要粘附分子表達(dá)的影響。方法:DENV-2感染C6/36細(xì)胞,提取細(xì)胞RNA,通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增DENV-2 NS1部分基因片段,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其擴(kuò)增產(chǎn)物。不同稀釋度的DENV-2病毒液感染C6/36細(xì)胞,利用TCID50法計(jì)算DENV-2的毒力。水平密度梯度離心法提取濃縮白細(xì)胞中的單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMC),貼壁分離單核細(xì)胞,用巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)刺激后,流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面CD14和CD11b分子。用10~3TCID50 DENV-2分別感染HUVECs和人巨噬細(xì)胞,且感染后兩者共培養(yǎng),QPCR(Quantitative PCR)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)DENV-2 NS1、VCAM-1、ICAM-1、E-selectin mRNA相對(duì)表達(dá)量。雙抗體夾心ELISA法分別檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)各組培養(yǎng)上清液中可溶性分子ICAM-1、VCAM-1、E-selectin的表達(dá)水平。結(jié)果:經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增DENV-2 NS1部分基因片段,瓊脂糖凝膠電泳后在400-500bp之間出現(xiàn)一明亮條帶,證明該病毒是DENV-2。根據(jù)TCID50法,DENV-2滴度為10~(-5.5)/0.1ml。流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定人巨噬細(xì)胞純度為(92.15±1.24)%。被DENV-2感染的HUVECs其病毒NS1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量呈先增加后降低趨勢(shì),在24h(1.25±0.16)達(dá)到峰值后逐漸下降;DENV-2感染人巨噬細(xì)胞的病毒NS1基因相對(duì)表達(dá)量呈先遞減后增加;共培養(yǎng)組中感染DENV-2的HUVECs的病毒NS1 mRNA各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)水平均高于HUVECs單獨(dú)感染組。DENV-2感染的HUVECs ICAM-1 mRNA相比未感染組,表達(dá)量于4h、72h上調(diào),8h、12h、24h、48h表達(dá)量下調(diào);VCAM-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平呈先增加后減低趨勢(shì),且在8h(1.6±0.04,P0.0001)達(dá)峰值;E-selectin mRNA相對(duì)表達(dá)水平呈減低趨勢(shì),且在感染后的4h、8h表達(dá)量上調(diào),12h、24h、48h、72h表達(dá)量下調(diào)。DENV-2感染巨噬細(xì)胞后ICAM-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量于4h(2.09±0.01,P0.0001)、8h(2.04±0.01,P0.0001)高于未感染組;但未檢測(cè)到VCAM-1 mRNA的表達(dá)。共培養(yǎng)組DENV感染的HUVECs ICAM-1、VCAM-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量與HUVECs單獨(dú)感染組相比8h后均上調(diào),且均在24h達(dá)峰值;感染后的HUVECs E-selectin mRNA于4h(1.20±0.08)表達(dá)水平最高,但各組相對(duì)表達(dá)量均低于共培養(yǎng)組。共培養(yǎng)組中感染DENV-2的HUVECs培養(yǎng)上清液其ICAM-1表達(dá)量均高于HUVECs單獨(dú)感染組;其表達(dá)E-selectin隨時(shí)間呈先遞增后降低,且在24h(6.12±1.03)表達(dá)量達(dá)峰值;但未檢測(cè)到培養(yǎng)上清液中VCAM-1的表達(dá)。結(jié)論:DENV-2能在HUVECs和人巨噬細(xì)胞中復(fù)制且能激活其細(xì)胞,被DENV-2感染激活的巨噬細(xì)胞能增強(qiáng)被感染的HUVECs的活化并增加其粘附分子的表達(dá)。
【圖文】：

A：正常 C6/36 細(xì)胞；B：細(xì)胞融合；C：空泡；D：網(wǎng)格狀圖 2-1 DENV-2 感染 C6/36 細(xì)胞 3-6 天內(nèi)細(xì)胞病變情況（×400）Fig.2-1 Cytopathic effect of C6/36 infected by DENV-2 within 3-6 days (×400)

r；2：DENV-2 NS1 部分序列擴(kuò)增產(chǎn)物膠電泳鑒定 DENV-2 NS1 部分序列擴(kuò)增產(chǎn)of DENV-2 NS1 partial gene products by ag 感染后，連續(xù)觀(guān)察 3-6 天，記錄不同，根據(jù) Reed-Muench 法計(jì)算 DEN。度 DENV-2 感染 C6/36 細(xì)胞后出現(xiàn) CPE 的e CPE of C6/36 cells infected by DENV-2無(wú)病變孔數(shù)累計(jì) 病變孔數(shù) 無(wú)病變孔數(shù)004032000 24 0
【學(xué)位授予單位】：貴州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2624817