【摘要】：目的:進一步驗證精子發(fā)生相關(guān)蛋白SPATA1與鞭毛內(nèi)轉(zhuǎn)運蛋白IFT20之間的相互作用,探索SPATA1在精子發(fā)生中的表達、定位及作用。方法:IFT20和SPATA1蛋白表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細胞,免疫熒光檢測其共定位;同時,IFT20/Flag和SPATA1/GFP共轉(zhuǎn)染COS-1細胞,細胞裂解物進行免疫共沉淀,進一步驗證兩者之間的相互作用。構(gòu)建SPATA1/pEGFP-N2質(zhì)粒,將其和對照質(zhì)粒pEGFP-N2轉(zhuǎn)染到COS-1細胞中,細胞裂解物進行Western blotting,檢測SPATA1多克隆抗體的特異性。以SPATA1和IFT20為一抗,免疫熒光染色觀察兩者在睪丸生精細胞的表達與定位。收集野生型小鼠附睪精子,Western blotting和免疫熒光檢測SPATA1在成熟精子中的表達。提取Ift20基因敲除小鼠和對照小鼠睪丸的總蛋白以及制備睪丸組織切片,Western blotting和免疫熒光檢測IFT20缺失對SPATA1在睪丸組織中的表達與定位的影響。結(jié)果:細胞內(nèi)蛋白定位實驗結(jié)果顯示IFT20和SPATA1在CHO細胞中部分共定位,形成簇團;COS-1細胞共轉(zhuǎn)染IFT20/Flag和SPATA1/GPF表達質(zhì)粒時,Flag抗體將IFT20和SPATA1同時沉淀下來。Western blotting實驗顯示制備的SPATA1抗體能有效識別該蛋白。小鼠睪丸組織和附睪成熟精子的免疫熒光染色顯示,在圓形精子細胞的頂體檢測到SPATA1蛋白信號,但在成熟精子未發(fā)現(xiàn)該蛋白的表達。IFT20也定位于圓形精子細胞的頂體。與對照組小鼠(Ift20~(flox/+);Stra8-Cre)相比,IFT20缺失對睪丸組織中SPATA1蛋白表達水平?jīng)]有顯著影響。免疫熒光結(jié)果顯示,精子發(fā)生的IV-XII期間,Ift20基因敲除小鼠和對照小鼠中SPATA1表達與定位相似;在精子發(fā)生第12階段(step12),Ift20基因敲除小鼠的精子細胞核未正常伸長,SPATA1未沿著頂體分布。結(jié)論:SPATA1與IFT20形成蛋白復合體,并可能通過調(diào)控IFT20介導的蛋白運輸參與精子頂體形成。
【圖文】：

SPATA1/pcDNA3 和 IFT20/GFP 分別或共同轉(zhuǎn)染 CHO 細胞，檢測 SPATA1 和 IFT20在細胞內(nèi)的定位。免疫熒光染色顯示，單獨轉(zhuǎn)染 SPATA1/pcDNA3 或 IFT20/GFP 時，SPATA1和IFT20呈現(xiàn)為囊泡狀分布在細胞質(zhì)中（圖4.2.1，上圖）。當 SPATA1/pcDNA3和 IFT20/GFP 共轉(zhuǎn)染 CHO 細胞時，它們部分共定位并聚積在細胞中（圖 4.2.1，，下圖）。此外，免疫共沉淀驗證了 SPATA1 和 IFT20 之間的相互作用。當 IFT20/Flag 和SPATA1/GFP 蛋白表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞時，F(xiàn)lag 抗體能同時免疫沉淀 Flag 標記的a b

2小鼠SPATA1和IFT20免疫共沉淀
【學位授予單位】：武漢科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R321.1

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本文編號：2624446