【摘要】：目的:進(jìn)一步驗(yàn)證精子發(fā)生相關(guān)蛋白SPATA1與鞭毛內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白IFT20之間的相互作用,探索SPATA1在精子發(fā)生中的表達(dá)、定位及作用。方法:IFT20和SPATA1蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,免疫熒光檢測(cè)其共定位;同時(shí),IFT20/Flag和SPATA1/GFP共轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞,細(xì)胞裂解物進(jìn)行免疫共沉淀,進(jìn)一步驗(yàn)證兩者之間的相互作用。構(gòu)建SPATA1/pEGFP-N2質(zhì)粒,將其和對(duì)照質(zhì)粒pEGFP-N2轉(zhuǎn)染到COS-1細(xì)胞中,細(xì)胞裂解物進(jìn)行Western blotting,檢測(cè)SPATA1多克隆抗體的特異性。以SPATA1和IFT20為一抗,免疫熒光染色觀察兩者在睪丸生精細(xì)胞的表達(dá)與定位。收集野生型小鼠附睪精子,Western blotting和免疫熒光檢測(cè)SPATA1在成熟精子中的表達(dá)。提取Ift20基因敲除小鼠和對(duì)照小鼠睪丸的總蛋白以及制備睪丸組織切片,Western blotting和免疫熒光檢測(cè)IFT20缺失對(duì)SPATA1在睪丸組織中的表達(dá)與定位的影響。結(jié)果:細(xì)胞內(nèi)蛋白定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示IFT20和SPATA1在CHO細(xì)胞中部分共定位,形成簇團(tuán);COS-1細(xì)胞共轉(zhuǎn)染IFT20/Flag和SPATA1/GPF表達(dá)質(zhì)粒時(shí),Flag抗體將IFT20和SPATA1同時(shí)沉淀下來(lái)。Western blotting實(shí)驗(yàn)顯示制備的SPATA1抗體能有效識(shí)別該蛋白。小鼠睪丸組織和附睪成熟精子的免疫熒光染色顯示,在圓形精子細(xì)胞的頂體檢測(cè)到SPATA1蛋白信號(hào),但在成熟精子未發(fā)現(xiàn)該蛋白的表達(dá)。IFT20也定位于圓形精子細(xì)胞的頂體。與對(duì)照組小鼠(Ift20~(flox/+);Stra8-Cre)相比,IFT20缺失對(duì)睪丸組織中SPATA1蛋白表達(dá)水平?jīng)]有顯著影響。免疫熒光結(jié)果顯示,精子發(fā)生的IV-XII期間,Ift20基因敲除小鼠和對(duì)照小鼠中SPATA1表達(dá)與定位相似;在精子發(fā)生第12階段(step12),Ift20基因敲除小鼠的精子細(xì)胞核未正常伸長(zhǎng),SPATA1未沿著頂體分布。結(jié)論:SPATA1與IFT20形成蛋白復(fù)合體,并可能通過(guò)調(diào)控IFT20介導(dǎo)的蛋白運(yùn)輸參與精子頂體形成。
【圖文】：

SPATA1/pcDNA3 和 IFT20/GFP 分別或共同轉(zhuǎn)染 CHO 細(xì)胞，檢測(cè) SPATA1 和 IFT20在細(xì)胞內(nèi)的定位。免疫熒光染色顯示，單獨(dú)轉(zhuǎn)染 SPATA1/pcDNA3 或 IFT20/GFP 時(shí)，SPATA1和IFT20呈現(xiàn)為囊泡狀分布在細(xì)胞質(zhì)中（圖4.2.1，上圖）。當(dāng) SPATA1/pcDNA3和 IFT20/GFP 共轉(zhuǎn)染 CHO 細(xì)胞時(shí)，它們部分共定位并聚積在細(xì)胞中（圖 4.2.1，，下圖）。此外，免疫共沉淀驗(yàn)證了 SPATA1 和 IFT20 之間的相互作用。當(dāng) IFT20/Flag 和SPATA1/GFP 蛋白表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，F(xiàn)lag 抗體能同時(shí)免疫沉淀 Flag 標(biāo)記的a b

2小鼠SPATA1和IFT20免疫共沉淀
【學(xué)位授予單位】：武漢科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R321.1

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本文編號(hào)：2624446