【摘要】：目的:研究人原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(primary human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)被登革熱2型病毒(Dengue virus 2,DENV-2)感染后,與單核細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的人巨噬細(xì)胞(Macrophages,M?)共培養(yǎng),觀察對(duì)兩種細(xì)胞分別產(chǎn)生主要炎性因子的影響。方法:密度梯度離心法從人體外周血濃縮白細(xì)胞中分離單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),貼壁得到單核細(xì)胞,通過(guò)巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)刺激,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD14~+CD11b~+細(xì)胞純度,得到M?。DENV-2感染HUVECs,Real-time PCR檢測(cè)HUVECs細(xì)胞內(nèi)病毒NS1 mRNA表達(dá)量變化。HUVECs被DENV-2感染后,通過(guò)Transwell法與M?共培養(yǎng),對(duì)照組用磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate S1P)1型特異性受體激動(dòng)劑CYM-5442預(yù)處理24h去除藥物后感染病毒。Real-time PCR分別檢測(cè)HUVECs產(chǎn)生的IL-6、IL-8 mRNA和M?產(chǎn)生的IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1βmRNA的逆轉(zhuǎn)錄水平;ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)培養(yǎng)上清中上述細(xì)胞因子的表達(dá)。結(jié)果:HUVECs被感染DENV-2后,細(xì)胞內(nèi)NS1基因轉(zhuǎn)錄水平逐漸上升,24h時(shí)達(dá)峰值(2.66±0.53,P0.05)后下降。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)M?純度為89.16±2.07%。HUVECs被DENV-2感染后IL-6、IL-8 mRNA轉(zhuǎn)錄水平均上調(diào),24h mRNA轉(zhuǎn)錄量達(dá)到峰值;IL-6為16.1±0.17,IL-8為29.76±0.58。未感染組轉(zhuǎn)錄水平IL-6為1.46±0.67,IL-8為1.6±0.54。M?被感染后IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1βmRNA表達(dá)量均有明顯上升,在24h mRNA IL-6表達(dá)量為45.82±3.72,IL-8為52.34±1.69(12h),TNF-α為28.94±1.75,IL-1β為30.96±1.44;未感染組轉(zhuǎn)錄水平IL-6為1.16±0.22,IL-8為1.15±0.21,TNF-α為1.11±0.09,IL-1β為1.47±0.31。HUVEC與M?共培養(yǎng)后上述細(xì)胞因子在各時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄水平有所下降,依然明顯高于未感染對(duì)照組。CYM-5442預(yù)處理后,共培養(yǎng)組感染的HUVEC IL-6、IL-8的mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯下降(P0.01),M?中IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1βmRNA轉(zhuǎn)錄水平也有下調(diào)(P0.01)。DENV-2感染的HUVEC與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)與未感染對(duì)照組相比,培養(yǎng)上清中IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-α、IL-1β分泌量明顯上升。結(jié)論:DENV-2能夠感染原代HUVECs,且被DENV-2感染的HUVEC能夠活化M?并促使其分泌大量的IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1β,同時(shí)CYM-5442預(yù)處理HUVECs后,能夠減少病毒感染HUVECs引起的主要細(xì)胞因子分泌量,一定程度減輕內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。
【圖文】：

注：1. Marker 2. NS1 序列擴(kuò)增圖 2-2 DENV-2 NS1 部分序列擴(kuò)增on of NS1 gene in C6/36 cells infectedV-2 毒力V-2 感染后，每天觀察細(xì)胞病變合等典型的病毒感染細(xì)胞病變（計(jì)算病毒 TCID50值為 10-5.8/0.1表 2-1 DENV-2 毒力測(cè)定（TCID5Tab. 2-1 DENV-2 Toxicity Test（TC無(wú)病變孔數(shù)累 計(jì)病變孔數(shù)無(wú)病變孔數(shù)0 42 0

蘇培養(yǎng)傳代后 2 天即可長(zhǎng)滿 95%左右，細(xì)胞貼壁呈梭型(圖 2-圖 2-3 HUVECs（×200）Fig.2-3 HUVECs（×200）細(xì)胞的鑒定PBMC，，貼壁后得到單核細(xì)胞，加入 M-CSF 刺激得到巨噬細(xì)胞（檢測(cè)巨噬細(xì)胞（M ）純度為 89.16±2.07%（圖 2-4）。
【學(xué)位授予單位】：貴州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2623682