【摘要】：(Ⅰ)肺炎鏈球菌ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Spr1677-78的結(jié)構(gòu)初探和底物篩選利用相容性溶質(zhì)對滲透壓進(jìn)行調(diào)節(jié)以抵抗細(xì)胞水分流失在原核、真核細(xì)胞和古細(xì)菌中都非常保守。因此,相容性溶質(zhì)的積累對于細(xì)胞抵御外界滲透壓的驟變至關(guān)重要。Spr1677-78可能是肺炎鏈球菌中負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)相容性溶質(zhì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。其中,Spr1677是具有跨膜結(jié)構(gòu)域和C端底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的膜蛋白,Spr1678是位于胞內(nèi)的ATP水解酶。在結(jié)構(gòu)方面,我們篩選出最適合于Spr1677-78復(fù)合物的去垢劑DDM和LMNG,并利用冷凍電鏡手段確定了Spr1677-78最合適的Nanodisc組裝條件。同時(shí),通過分析Spr1677柔性區(qū)域的長度和二級結(jié)構(gòu),我們構(gòu)建了多個截短版本并篩選出了最優(yōu)版本用于后續(xù)的結(jié)構(gòu)研究。在功能方面,我們通過基因敲除結(jié)合表型微陣列實(shí)驗(yàn)篩選出了Spr1677-78可能的底物小分子。雖然進(jìn)一步的生化實(shí)驗(yàn)并未檢測出Spr1677-78的底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域與這些小分子的結(jié)合,但是它們很可能與Spr1677-78的生理轉(zhuǎn)運(yùn)底物具有相似的核心結(jié)構(gòu)。此外,我們還克隆表達(dá)以及純化了與Spr1677-78位于同一操縱子的另外一個未知功能蛋白Spr1679,并對它的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步的研究。這個蛋白可能與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Spr1677-78的功能密不可分。(Ⅱ)肺炎鏈球菌膽堿結(jié)合蛋白CbpJ的功能研究肺炎鏈球菌主要有三類表面蛋白,即脂蛋白、攜帶LPXTG共有序列的蛋白和膽堿結(jié)合蛋白。膽堿結(jié)合蛋白一般至少由兩種結(jié)構(gòu)域組成:N端的功能結(jié)構(gòu)域和C端的高度保守的膽堿結(jié)合結(jié)構(gòu)域。其中,膽堿結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以通過非共價(jià)相互作用,將膽堿結(jié)合蛋白錨定在細(xì)胞壁的磷酸膽堿分子上。前人的研究表明CbpJ(SP_0378)可能是一種粘附蛋白。為了驗(yàn)證其功能,我們構(gòu)建了肺炎鏈球菌TIGR4的cbpJ基因敲除菌株,發(fā)現(xiàn)cbpJ敲除菌株喪失了90%的粘附能力。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CbpJ的N-domain(潛在的功能結(jié)構(gòu)域)缺失突變菌株仍然保留約70%的粘附活性,而C-domain(膽堿結(jié)合結(jié)構(gòu)域)缺失突變菌株則喪失90%的粘附活性,這表明CbpJ的N末端雖然參與肺炎球菌對呼吸道上皮細(xì)胞的粘附,但并不是不可缺少的。我們的研究表明CbpJ蛋白的膽堿結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)τ诜窝祖溓蚓恼掣绞遣豢苫蛉钡�。這項(xiàng)工作加深了我們對肺炎鏈球菌表面蛋白的理解,為藥物設(shè)計(jì)提供了潛在的新靶標(biāo)。
【圖文】：

邐＼逡逑圖１．２邋ＡＢＣ轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的分類［４｜逡逑依據(jù)結(jié)構(gòu)特征可以將Ｉｍｐｏｒｔｅｒｓ分為以下三類（圖１．２）：逡逑１．邐Ｔｙｐｅ邋Ｉ：每個ＴＭＤ具有６個跨膜螺旋，相較于Ｔｙｐｅ邋ＩＩ型ＡＢＣ轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，逡逑其ＳＢＤ對底物親和力相對要低一些；此外，ＴＭＤ內(nèi)部還有一個底物結(jié)合位點(diǎn)逡逑［２３］，，但是這個位點(diǎn)親和力要稍微低一些。逡逑２．邐Ｔｙｐｅ邋ＩＩ：相對Ｔｙｐｅ邋Ｉ、Ｔｙｐｅ邋ＩＩ型ＡＢＣ轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，艮Ｐ逡逑ＴＭＤ具有１０次跨膜螺旋，有更高親和力的ＳＢＤ。雖然沒有ＴＭＤ之間的底物逡逑結(jié)合位點(diǎn)，但是其在轉(zhuǎn)運(yùn)各個界面具有ｇａｔｅ來控制轉(zhuǎn)運(yùn)方向。逡逑３．邐ＥＣＦ轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白：由四個亞基組成，包括２個ＮＢＤ、１個ＴＭＤ和一個定逡逑位于細(xì)胞膜的Ｓ邋ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｅＥＣＦ轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不需要ＳＢＤ結(jié)合底物

邐第一章研究背景邐逡逑所有的微生物細(xì)胞都擁有一個正向的膨脹壓。據(jù)估計(jì)，這種由胞內(nèi)向胞外逡逑的正向膨脹壓在革蘭氏陰性和陽性菌中分別大概為３－１０Ｘ１０５Ｐａ和２０Ｘ１０５逡逑Ｐａ［２４］。這種正向壓的維持不僅能夠幫助微生物抵抗外界高滲透壓造成的傷害，逡逑抵御外界高滲透壓造成的細(xì)胞物質(zhì)外流；更重要的是，它是細(xì)胞體積增大的一逡逑種主要驅(qū)動力。逡逑那么細(xì)胞如何維持這樣的膨脹壓呢？由于微生物并沒有主動運(yùn)輸水分子的逡逑機(jī)制，而主要由在胞內(nèi)從頭合成、或者向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)一類電中性的、且具有滲透逡逑壓調(diào)節(jié)能力的小分子，即相容性溶質(zhì)（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ邋ｓｏｌｕｔｅｓ），來調(diào)節(jié)合適的滲透逡逑壓［２５］。滲透保護(hù)劑或相容性溶質(zhì)是一種小分子，起著調(diào)節(jié)滲透壓的作用，幫逡逑助生物體在極端的滲透壓力下生存。逡逑相容性溶質(zhì)具有以下特點(diǎn)：它們呈電中性，并且和胞內(nèi)生理代謝活動高度逡逑相容，具有生物惰性；它們的種類極其有限，并且這些有限種類的相容性溶質(zhì)逡逑在各個物種例如古細(xì)菌、原核生物以及真核細(xì)胞中都是高度保守的。相容性溶逡逑質(zhì)主要有五類：糖類（如：海藻糖）；多醇類（如：甘油）；氨基酸類（如：脯逡逑°°逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R378

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本文編號：2618493