【摘要】：背景:剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種屬于真球蟲目(Eucoccidiorid)、弓形蟲科(Toxoplasmatidae)、弓形蟲屬(Toxoplasma)的專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲,根據(jù)蟲體對小鼠毒力的差異可以將弓形蟲分為3型。弓形蟲的先天性垂直傳播則是導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局的重要致畸因子之一。弓形蟲可以經(jīng)胎盤侵犯胎兒,在孕后不同時期感染導(dǎo)致嚴(yán)重后果。當(dāng)前研究弓形蟲引發(fā)異常妊娠的機(jī)理多集中在免疫學(xué)角度,而弓形蟲與胚胎發(fā)育過程相關(guān)細(xì)胞的相互作用研究相對較少。弓形蟲完成宿主細(xì)胞內(nèi)生活過程所分泌釋放的多種蛋白具有調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞功能的作用。例如弓形蟲ROP18和GRA15均可通過宿主細(xì)胞NFκB影響宿主細(xì)胞的基因表達(dá)。弓形蟲ROP16蛋白同樣在不同蟲株間存在多態(tài)性。I型和III型蟲株(如RH,CTG)ROP16_(I/III)蛋白可以通過直接和宿主細(xì)胞的Stat3結(jié)合,磷酸化Stat3的705位的酪氨酸。弓形蟲蛋白ROP16可以磷酸化宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子Stat3,并且部分抑制宿主細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞分化。而動物妊娠早期胚胎著床的EMT現(xiàn)象也有Stat 3的參與,并且伴有細(xì)胞的增殖、分化。目的:從細(xì)胞凋亡和MET兩個方面研究弓形蟲蛋白ROP16對小鼠妊娠的影響,揭示ROP16的互作蛋白,闡明ROP16引發(fā)小鼠不良妊娠的分子機(jī)理。方法:體外實驗部分主要通過培養(yǎng)小鼠妊娠的子宮基質(zhì)細(xì)胞,并將其轉(zhuǎn)染重組ROP16_(I/III)慢病毒,用流式細(xì)胞術(shù)、Western blotting和Real-Time PCR的方法檢測細(xì)胞凋亡比率、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá)水平;體外驗證ROP16_(I/III)在小鼠蛻膜化過程中對MET的影響:培養(yǎng)小鼠妊娠第四天的子宮基質(zhì)細(xì)胞,誘導(dǎo)其蛻膜化,轉(zhuǎn)染。用Western blot和Real-Time PCR的方法檢測MET相關(guān)的標(biāo)志分子Vimentin、E-cadherin和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)變化,檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄情況。體內(nèi)實驗主要是通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方法將ROP16_(I/III)體內(nèi)注射到妊娠期第4天的小鼠子宮,取第8天小鼠子宮,體外將著床位點(diǎn)的組織分離,提取RNA或蛋白,用Real-Time PCR或Western blot檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。免疫組化檢測著床位點(diǎn)的細(xì)胞凋亡水平;體內(nèi)驗證ROP16_(I/III)蛻膜化的影響:觀察其妊娠率、胚胎著床數(shù)目,稱量蛻膜組織的重量。另外將著床位點(diǎn)的組織分離,提取RNA或蛋白,用Real-Time PCR或Western blot檢測MET相關(guān)的標(biāo)志分子和轉(zhuǎn)錄因子。結(jié)果:(1)提取的小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞純度為(95±2.5)%,在體外誘導(dǎo)蛻膜化后,PRL mRNA的表達(dá)隨時間增長而顯著升高(p0.05)。(2)在誘導(dǎo)蛻膜化的蛻膜細(xì)胞中過表達(dá)ROP16,細(xì)胞流式術(shù)結(jié)果顯示:相比于對照組,ROP16慢病毒轉(zhuǎn)染組蛻膜細(xì)胞的凋亡率降低(p0.05),蛻膜細(xì)胞凋亡蛋白BAX表達(dá)明顯降低,BCL-2蛋白表達(dá)上調(diào)。(3)在誘導(dǎo)蛻膜化的蛻膜細(xì)胞中過表達(dá)ROP16,運(yùn)用qRT-PCR對各組細(xì)胞的ZEB1、E-Cadherin和Vimentin的mRNA進(jìn)行定量研究,結(jié)果顯示:相比于對照組,ROP16轉(zhuǎn)染組的ZEB1和Vimentin的mRNA表達(dá)升高(p0.05),而E-Cadherin的mRNA表達(dá)降低。(4)小鼠懷孕第4天,子宮角注射ROP16慢病毒或空載慢病毒陰性對照,待第8天取出小鼠子宮,觀察小鼠胚胎著床數(shù)量,結(jié)果顯示:相對于對照組,ROP16轉(zhuǎn)染組的小鼠子宮胚胎著床率顯著下降(p0.05)。(5)取上述步驟的第8天子宮模型,免疫組化檢測Bax、Bcl-2的表達(dá)及分布,結(jié)果與Western blot結(jié)果一致。結(jié)論:蛻膜化過程中,弓形蟲ROP16蛋白會抑制蛻膜細(xì)胞的凋亡,可能會影響蛻膜細(xì)胞增殖與凋亡的平衡從而影響胚胎的植入。同時,在蛻膜化過程中。ROP16蛋白會影響子宮基質(zhì)細(xì)胞的MET。實驗結(jié)果表明,在著床前期的孕鼠子宮經(jīng)子宮角注射ROP16慢病毒后,胚胎著床率會顯著降低,說明了弓形蟲ROP16蛋白會通過影響孕鼠子宮內(nèi)蛻膜化進(jìn)程而導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局。
【圖文】：

圖 1 小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的鑒定（×200）Figure 1Identification of purity of mouse endometrial cell(A)熒光顯微鏡下觀察基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物 Vimentin 蛋白。（B）熒光顯微鏡下觀察 DAPI 染色的細(xì)胞核。（C）合并觀察計數(shù)波形蛋白陽性細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞總數(shù)。

圖 2 小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)蛻膜化(x200)Figure 2 Decidualization of stromal cells induced with P4,E2 plus cAMP treatment(A)明場下觀察小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞。(B)經(jīng)過體外誘導(dǎo)蛻膜化后，明場下觀察蛻膜細(xì)胞。(C) 小
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R382.5

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本文編號：2618895